Summary

חיתוך ולבבות חזיר מקולף בתנאים פיסיולוגיים

Published: March 20, 2020
doi:

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד לחתוך את רקמת הלב והתרבות בתנאים פיסיולוגיים במשך 6 ימים. מערכת זו של התרבות יכול לשמש פלטפורמה לבדיקת היעילות של אי ספיקת לב הרומן therapeutics, כמו גם בדיקות אמינות של הקרדיוקרדיטיות חריפה במודל לב תלת-ממדי.

Abstract

תרופות הרומן הרבות להיכשל במחקרים קליניים בשל תופעות לוואי cardiotoxic כמו כיום זמין מחוץ לתחום במודלים בעלי חיים vivo לחזות התחייבויות לב האדם, פוזות נטל רב מיליארד דולר על תעשיית התרופות. לפיכך, יש צורך רפואי ברחבי העולם לגישות טובות יותר כדי לזהות קרדיולוקסיניטי סמים לפני התחייבות יקר זמן רב ‘ הראשון במבחנים של האדם. כיום, רק תאים לב בלתי מפותחים (האדם המושרה ביותר בתאי גזע הנגרמת על ידי מערכת החייאה) משמשים כדי לבדוק יעילות טיפולית רעילות הסמים כפי שהם היחידים בתאי הלב האנושיים שיכולים להיות מתורבתים לתקופות ממושכות נדרש כדי לבדוק את יעילות הסמים ואת הרעילות. עם זאת, סוג תא בודד אינו יכול לשכפל את הפנוטיפ של רקמת הלב 3D מורכבת אשר נוצרת של סוגי תאים מרובים. וחשוב מכך, השפעת הסמים צריכה להיבדק על הקרדיוציטים מבוגרים, שיש להם מאפיינים שונים ותגובות רעילות בהשוואה ל-היפנוסק-CMs בלתי-מפותח. הפרוסות של לב האדם מהווה מודל מבטיח של שריר הלב האנושי ללא פגע. טכנולוגיה זו מספקת גישה למערכת מסחר מלאה המחקה את רקמת הלב האנושית ומשקפת את התנאים הפיזיולוגיים או הפתולוגיים של שריר הלב האנושי. לאחרונה, באמצעות אופטימיזציה של רכיבי מדיה התרבות ותנאי התרבות לכלול גירוי חשמלי רציף ב 1.2 Hz ו חמצן לסירוגין של מדיום התרבות, פיתחנו התקנה חדשה של מערכת התרבות אשר שומרת על יכולת הקיום והפונקציונליות של פרוסות לב של אדם וחזיר למשך 6 ימים בתרבות. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מפרט את השיטה לחיתוך לב חזיר מקולף כדוגמה. אותו פרוטוקול משמש גם לפרוסות תרבות מלבבות אנושיים, כלבים, כבשים או חתולים. זו מערכת התרבות יש את הפוטנציאל להיות האדם ניבוי חזק במודל באתרו עבור בדיקות קרדיולקסיטיות חריפה הסוגרת את הפער בין תוצאות בדיקה קלינית קליני.

Introduction

שיטת התרופות הנגרמת היא גורם מרכזי לגמילה משוק1. בעשור האחרון של המאהה -20, שמונה תרופות ללא לב וכלי דם הונסוגו מן השוק כתוצאה מכך מוות פתאומי בשל הפרעות קצב הלב2. בנוסף, מספר טיפולים נגד סרטן (בעוד במקרים רבים יעיל) יכול להוביל לכמה אפקטים cardiotoxic כולל שריר הלב הפרעות קצב. לדוגמה, הן מסורתיות (למשל, פחם וקרינה) ו ממוקד (g., trastuzumab) טיפולים סרטן השד יכול לגרום לסיבוכים לב וכלי דם בקבוצת משנה של חולים3. שיתוף פעולה קרוב בין קרדיולוגים ו אונקולוגים (באמצעות השדה המתעוררים של “סיבולת לב ריאה”) עזר להפוך את הסיבוכים האלה לניהול להבטיח כי חולים יכולים להיות מטופלים ביעילות2. פחות ברור הם השפעות לב וכלי דם של סוכנים חדשים, כולל Her2 ו PI3K מעכבי, במיוחד כאשר הטיפולים משמשים בשילוב. לכן, יש צורך הולך וגדל אסטרטגיות ההקרנה הקדם קלינית עבור רעלים קרדיווסטיים הקשורים המתעוררים נגד סרטן טיפולים לפני ניסויים קליניים אנושיים. חוסר הזמינות של מערכות התרבות לרקמת הלב האנושית כי הוא פונקציונלי מבחינה מבנית עבור יותר מ -24 h הוא גורם מגביל עבור בדיקות הקרדיולוקסיטי אמין. לכן, יש צורך דחוף לפתח מערכת אמינה עבור רקמת לב האדם culturing בתנאים פיזיולוגיים לבדיקת רעילות לסמים.

המהלך האחרון לקראת השימוש של האדם המושרה הנגרמת לתאי גזע-הקרדיוציטים (היפנוטית-CMs) בבדיקות קרדיולוקסיטי סיפקה פתרון חלקי לטיפול בבעיה זו; עם זאת, הטבע בוגר של היפנוsc-CMs ואובדן שלמות רקמות בהשוואה לטבע רב-תאי של רקמת הלב הם מגבלות גדולות של טכנולוגיה זו4. מחקר שנערך לאחרונה התגבר באופן חלקי על מגבלה זו באמצעות הייצור של רקמות לב מ-היפרsc-CMs על הידרוג ‘ לים והוא החזיק אותם לעלייה הדרגתית גירוי חשמלי לאורך זמן5. עם זאת, התכונות האלקטרו-מכאני שלהם לא השיגו את הבגרות הנתפסת בשריר הלב האנושי המבוגר. יתר על כן, רקמת הלב הוא מורכב יותר מבחינה מבנית, להיות מורכב מסוגי תאים שונים כולל תאים אנדותל, נוירונים וסוגים שונים של מסטרומה פיברותקיעות מקושרים יחד עם תערובת ספציפית מאוד של חלבונים מטריתאיים מטריצות6. הטרוגניות הזאת של אוכלוסיית התאים הבלתי-קרדיוציט7,8,9 בליבו של היונקים הגדולים הוא מכשול משמעותי ברקמת לב מידול באמצעות סוגי תאים נפרדים. מגבלות גדולות אלה מדגישות את החשיבות של פיתוח שיטות להפיכת התרבות של רקמת לב שלמה למחקרים אופטימליים הכרוכים בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים של הלב5.

מודל מבטיח של שריר הלב. האנושי ללא פגע טכנולוגיה זו מספקת גישה למערכת מלאה 3D הרב-תאיים הדומה לרקמת הלב האנושי אשר יכול באופן מהימן לשקף את התנאים הפיזיולוגיים או הפתולוגיים של שריר הלב האנושי. עם זאת, השימוש שלו כבר מוגבל באופן חמור על ידי התקופה הקצרה של הכדאיות בתרבות, אשר לא להאריך מעבר 24 h באמצעות הפרוטוקולים החזקים ביותר שדווחו עד 201810,11,12. מגבלה זו הייתה בשל גורמים מרובים, לרבות השימוש בממשק נוזלי האוויר לתרבות הפרוסות, והשימוש במדיום תרבותי פשוט שאינו תומך בדרישות האנרגטיות הגבוהות של רקמת הלב. פיתחנו לאחרונה מערכת תרבות מתחת לגוף, אשר מסוגלת לספק גירוי חשמלי רציף ואופטימיזציה של רכיבי מדיה התרבות כדי לשמור פרוסות רקמות לב קיימא עד 6 ימים13. זו מערכת התרבות יש את הפוטנציאל להיות האדם ניבוי חזק במודל באתרו עבור בדיקות קרדיולקסיטיות חריפה כדי לסגור את הפער בין תוצאות בדיקה קלינית קליני. במאמר הנוכחי, אנו מפרט את הפרוטוקול לחיתוך ולתפירה של פרוסות הלב באמצעות לב חזיר כדוגמה. אותו תהליך מוחל על לבבות אנושיים, כלבים, כבשים או חתולים. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מקווים להפיץ את הטכנולוגיה למעבדות אחרות בקהילה המדעית.

Protocol

כל נוהלי החיות היו בהתאם להנחיות המוסדיים של אוניברסיטת לואיוויל ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש. 1. הכנה לפריסה (יום אחד לפני החיתוך) הכנת מיקרוטומה הרוטטת הניחו את הלהב הקרמי לתוך המחזיק בו באמצעות הצעדים הבאים: לאחר הסרת הלהב בזה?…

Representative Results

באמצעות ממריץ מסחרי של תרבות התא הזמין מסחרית כי יכול להכיל שמונה 6 צלחות היטב בבת אחת, אנו לחיקוי של למבוגרים את הסביבה הלב על ידי גרימת גירוי חשמלי בתדר הפיזיולוגי (1.2 Hz), והוקרן עבור רכיבים בינוניים בסיסיים כדי להאריך את המשך של פרוסות לב של חזיר פונקציונלי בתרבות<sup class="x…

Discussion

כאן אנו מתארים את פרוטוקול וידאו מפורט עבור השיטה שפורסמה לאחרונה עבור תפוקה בינונית פשוטה (תהליכים עד 48 פרוסות/התקן) שיטה המאפשרת תרבות של פרוסות לב חזיר לתקופה ארוכה מספיק כדי לבדוק את הקרדיולקסיניטי החריפה13. התנאים המוצעים מחקים את הסביבה של הלב, כולל תדירות של גירוי חשמלי…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

TMAM נתמך על ידי NIH מענק P30GM127607 ואיגוד הלב האמריקאי המענק 16SDG29950012. RB נתמכת על ידי P01HL78825 ו-UM1HL113530.

Materials

1000ml, 0.22µm, Vacuum Filter/Storage Systems VWR 28199-812
2,3-Butanedione monoxime (BDM) Fisher AC150375000
500ml, 0.22µm, Vacuum Filter/Storage Systems VWR 28199-788
6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover) Ion Optix CLD6WFC
6-well plates Fisher 08-772-1B
Agarose Bioline USA BIO-41025
Antibiotic-Antimycotic Thermo 15-240-062
C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator) Ion Optix CEP100
Calcium Chloride (CaCl2) Fisher C79-500
Ceramic Blades for Vibrating Microtome Campden Instruments 7550-1-C
Cooley Chest Retractor Millennium Surgical 63-G5623
D-Glucose Fisher D16-1
Disposable Scalpel #20 Biologyproducts.com DS20X
Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning VWR 21008-952
Fetal Bovine Serum Thermo A3160502
Graefe Forceps Fisher NC9475675
Heparin sodium salt Sigma-Aldrich H3149-50KU
HEPES Fisher BP310-1
Histoacryl BLUE Tissue glue Amazon https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/
Iris Spring scissors Fisher NC9019530
Iris Straight Scissors Fisher 731210
Isoflurane, USP Piramal NDC 66794-017-25
ITS Liquid Media Supplement Sigma-Aldrich I3146-5ML
Ketamine HCl (500 mg/10 mL) West-Ward NDC 0143-9508
Magnesium Chloride (MgCl2) Fisher M33-500
Mayo SuperCut Surgical Scissors AROSurgical Instruments Corporation AROSuperCut™ 07.164.17
Medium 199, Earle's Salts Thermo 11-150-059
Oxygen regulator Praxair
Oxygen tanks – Praxair
Plastic Pasteur pipettes Fisher 13-711-48
Potassium Chloride (KCl) Fisher AC193780010
Printer Timing Belt Amazon https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/
Razor rectangle blades Fisher 12-640
Recombinant Human FGF basic R&D Systems 233-FB-025/CF
Recombinant Human VEGF R&D Systems 293-VE-010/CF
Retractable scalpels Fisher 22-079-716
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Fisher AC217125000
Sodium Chloride (NaCl) Fisher AC327300010
Vibrating Microtome Campden Instruments 7000 SMZ-2
Xylazine HCl (100 mg/mL) Heartland Veterinary Supply NADA 139-236

References

  1. Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature. BMC Medicine. 14, 10 (2016).
  2. Fermini, B., Fossa, A. A. The impact of drug-induced QT interval prolongation on drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (6), 439-447 (2003).
  3. Moslehi, J. J. Cardiovascular Toxic Effects of Targeted Cancer Therapies. The New England Journal of Medicine. 375 (15), 1457-1467 (2016).
  4. Robertson, C., Tran, D. D., George, S. C. Concise review: maturation phases of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 31 (5), 829-837 (2013).
  5. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  6. Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
  7. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
  8. Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigations. 128 (5), 2127-2143 (2018).
  9. Kretzschmar, K., et al. Profiling proliferative cells and their progeny in damaged murine hearts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (52), E12245-E12254 (2018).
  10. Perbellini, F., et al. Investigation of cardiac fibroblasts using myocardial slices. Cardiovascular Research. 114 (1), 77-89 (2018).
  11. Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
  12. Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798 (2016).
  13. Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
  14. Jones, S. P., et al. The NHLBI-sponsored Consortium for preclinicAl assESsment of cARdioprotective therapies (CAESAR): a new paradigm for rigorous, accurate, and reproducible evaluation of putative infarct-sparing interventions in mice, rabbits, and pigs. Circulation Research. 116 (4), 572-586 (2015).
  15. Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. Journal of Anatomy. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).
  16. Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 117 (2019).
  17. Franke, J., Abs, V., Zizzadoro, C., Abraham, G. Comparative study of the effects of fetal bovine serum versus horse serum on growth and differentiation of primary equine bronchial fibroblasts. BMC Veterinary Research. 10, 119 (2014).
  18. Vuorenpaa, H., et al. Novel in vitro cardiovascular constructs composed of vascular-like networks and cardiomyocytes. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 50 (4), 275-286 (2014).
  19. Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 139-150 (2018).
  20. Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 2168 (2019).
check_url/60913?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Ou, Q., Abouleisa, R. R., Tang, X., Juhardeen, H. R., Meki, M. H., Miller, J. M., Giridharan, G., El-Baz, A., Bolli, R., Mohamed, T. M. Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions. J. Vis. Exp. (157), e60913, doi:10.3791/60913 (2020).

View Video