Snijden en kweken Varkensharten onder fysiologische omstandigheden
Summary
Dit protocol beschrijft hoe hartweefsel te snijden en te kweken onder fysiologische omstandigheden gedurende 6 dagen. Dit cultuursysteem kan worden gebruikt als een platform voor het testen van de werkzaamheid van nieuwe harthartfalen therapieën evenals betrouwbare testen van acute cardiotoxiciteit in een 3D-hartmodel.
Abstract
Veel nieuwe geneesmiddelen mislukken in klinische studies als gevolg van cardiotoxische bijwerkingen als de momenteel beschikbare in vitro tests en in vivo diermodellen slecht voorspellen menselijke hartverplichtingen, die een multi-miljard dollar last voor de farmaceutische industrie. Vandaar, is er een wereldwijde onvervulde medische behoefte aan betere benaderingen om drugcardiotoxiciteit te identificeren alvorens dure en tijdrovende ‘eerst in de mens’ proeven aan te gaan. Momenteel worden alleen onrijpe hartcellen (door de mens geïnduceerde pluripotente cardiomyocyten uit stamcellen [hiPSC-CMs]) gebruikt om therapeutische efficiëntie en medicijntoxiciteit te testen, omdat ze de enige menselijke hartcellen zijn die langdurig kunnen worden gekweekt nodig is om de werkzaamheid en toxiciteit van geneesmiddelen te testen. Een enkelceltype kan echter het fenotype van het complexe 3D-hartweefsel dat wordt gevormd uit meerdere celtypen niet repliceren. Belangrijk is dat het effect van geneesmiddelen moet worden getest op volwassen cardiomyocyten, die verschillende kenmerken en toxiciteitreacties hebben in vergelijking met onrijpe hiPSC-CMs. Het kweken van menselijke hartschijfjes is een veelbelovend model van intact menselijk myocardium. Deze technologie biedt toegang tot een compleet meercellig systeem dat het menselijk hartweefsel nabootst en de fysiologische of pathologische omstandigheden van het menselijke myocardium weerspiegelt. Onlangs, door optimalisatie van de cultuur media componenten en de cultuur voorwaarden aan continue elektrische stimulatie op 1,2 Hz en intermitterende oxygenatie van de cultuur medium op te nemen, ontwikkelden we een nieuwe cultuur systeem setup die levensvatbaarheid behoudt en functionaliteit van mens en varken hart plakjes voor 6 dagen in de cultuur. In het huidige protocol geven we als voorbeeld de methode voor het snijden en kweken van varkenshart. Hetzelfde protocol wordt gebruikt om plakjes uit menselijke, honden-, schapen- of kattenharten te kweken. Dit cultuursysteem heeft het potentieel om een krachtig voorspellend human in situ-model te worden voor acute cardiotoxiciteitstests die de kloof tussen preklinische en klinische testresultaten dichten.
Introduction
Drug geïnduceerde cardiotoxiciteit is een belangrijke oorzaak van de terugtrekking van de markt1. In het laatste decennium van de20e eeuw werden acht niet-cardiovasculaire geneesmiddelen uit de markt genomen omdat ze resulteerden in een plotselinge dood als gevolg van ventriculaire hartritmestoornissen2. Bovendien kunnen verschillende anti-kankertherapieën (hoewel in veel gevallen effectief) leiden tot verschillende cardiotoxische effecten, waaronder cardiomyopathie en hartritmestoornissen. Zo kunnen zowel traditionele (bijvoorbeeld anthracyclines en bestraling) als gerichte (bijvoorbeeld trastuzumab) borstkankertherapieën leiden tot cardiovasculaire complicaties bij een subgroep van patiënten3. Een nauwe samenwerking tussen cardiologen en oncologen (via het opkomende veld van “cardio-oncologie”) heeft geholpen om deze complicaties beheersbaar te maken ervoor te zorgen dat patiënten effectief kunnen worden behandeld2. Minder duidelijk zijn de cardiovasculaire effecten van nieuwere stoffen, waaronder Her2- en PI3K-remmers, vooral wanneer therapieën in combinatie worden gebruikt. Daarom is er een groeiende behoefte aan betrouwbare preklinische screening strategieën voor cardiovasculaire toxiciteit in verband met opkomende anti-kanker therapieën voorafgaand aan menselijke klinische proeven. Het gebrek aan beschikbaarheid van kweeksystemen voor menselijk hartweefsel dat functioneel en structureel levensvatbaar is voor meer dan 24 uur is een beperkende factor voor betrouwbare cardiotoxiciteitstests. Daarom is er een dringende noodzaak om een betrouwbaar systeem te ontwikkelen voor het kweken van menselijk hartweefsel onder fysiologische omstandigheden voor het testen van toxiciteit van geneesmiddelen.
De recente stap naar het gebruik van door de mens geïnduceerde pluripotente cardiomyocyten (hiPSC-CMs) in cardiotoxiciteitstests heeft een gedeeltelijke oplossing geboden om dit probleem aan te pakken; echter, de onrijpe aard van de hiPSC-CMs en het verlies van weefsel integriteit in vergelijking met meercellige aard van het hartweefsel zijn belangrijke beperkingen van deze technologie4. Een recente studie heeft deze beperking gedeeltelijk overwonnen door de fabricage van hartweefsels van hiPSC-CMs op hydrogels en hen te onderwerpen aan een geleidelijke toename van elektrische stimulatie in de loop van de tijd5. Echter, hun elektromechanische eigenschappen niet bereiken van de volwassenheid gezien in de volwassen menselijke myocardium. Bovendien is het hartweefsel structureel ingewikkelder, dat bestaat uit verschillende celtypen, waaronder endotheelcellen, neuronen en verschillende soorten stromale fibroblasten die zijn gekoppeld aan een zeer specifiek mengsel van extracellulaire matrixeiwitten6. Deze heterogeniteit van de niet-cardiomyocyte celpopulatie7,8,9 in het volwassen zoogdierhart is een belangrijk obstakel bij het modelleren van hartweefsel met behulp van individuele celtypen. Deze belangrijke beperkingen benadrukken het belang van het ontwikkelen van methoden om de kweek van intact hartweefsel mogelijk te maken voor optimale studies met fysiologische en pathologische aandoeningen van het hart5.
Het kweken van menselijke hartplakken is een veelbelovend model van intact menselijk myocardium. Deze technologie biedt toegang tot een compleet 3D meercellig systeem dat vergelijkbaar is met het menselijk hartweefsel dat betrouwbaar de fysiologische of pathologische omstandigheden van het menselijke myocardkanon kan weerspiegelen. Het gebruik ervan is echter ernstig beperkt door de korte periode van levensvatbaarheid in de cultuur, die niet verder reikt dan 24 uur met behulp van de meest robuuste protocollen die tot 201810,11,12worden gemeld . Deze beperking was te wijten aan meerdere factoren, waaronder het gebruik van lucht-vloeistof interface om de cultuur van de plakjes, en het gebruik van een eenvoudige cultuur medium dat niet ondersteunt de hoge energetische eisen van het hartweefsel. We hebben onlangs een ondergedompeld kweeksysteem ontwikkeld dat in staat is om continue elektrische stimulatie te bieden en de componenten van de cultuurmedia te optimaliseren om hartweefselplakjes tot 6 dagen13levensvatbaar te houden. Dit cultuursysteem heeft het potentieel om een krachtig voorspellend human in situ-model te worden voor acute cardiotoxiciteitstests om de kloof tussen preklinische en klinische testresultaten te dichten. In het huidige artikel, we zijn detaillering het protocol voor het snijden en kweken van het hart plakjes met behulp van een varkenshart als voorbeeld. Hetzelfde proces wordt toegepast op menselijke, hond, schapen of kattenharten. Met dit protocol hopen we de technologie te verspreiden naar andere laboratoria in de wetenschappelijke gemeenschap.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we de gedetailleerde video protocol voor onze onlangs gepubliceerde methode voor vereenvoudigde medium doorvoer (processen tot 48 plakjes / apparaat) methode die cultuur van varkenshart plakjes mogelijk maakt voor een periode die voldoende lang is om acute cardiotoxiciteit te testen13. De voorgestelde omstandigheden bootsen de omgeving van het hart na, inclusief de frequentie van elektrische stimulatie, beschikbaarheid van voedingsstoffen en intermitterende oxygenatie. We schrijve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TMAM wordt ondersteund door NIH grant P30GM127607 en American Heart Association grant 16SDG29950012. RB wordt ondersteund door P01HL78825 en UM1HL113530.
Materials
| 1000ml, 0.22µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-812 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Fisher | AC150375000 | |
| 500ml, 0.22µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-788 | |
| 6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover) | Ion Optix | CLD6WFC | |
| 6-well plates | Fisher | 08-772-1B | |
| Agarose | Bioline USA | BIO-41025 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo | 15-240-062 | |
| C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator) | Ion Optix | CEP100 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher | C79-500 | |
| Ceramic Blades for Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7550-1-C | |
| Cooley Chest Retractor | Millennium Surgical | 63-G5623 | |
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Disposable Scalpel #20 | Biologyproducts.com | DS20X | |
| Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning | VWR | 21008-952 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | A3160502 | |
| Graefe Forceps | Fisher | NC9475675 | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Histoacryl BLUE Tissue glue | Amazon | https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/ | |
| Iris Spring scissors | Fisher | NC9019530 | |
| Iris Straight Scissors | Fisher | 731210 | |
| Isoflurane, USP | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| Ketamine HCl (500 mg/10 mL) | West-Ward | NDC 0143-9508 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher | M33-500 | |
| Mayo SuperCut Surgical Scissors | AROSurgical Instruments Corporation | AROSuperCut™ 07.164.17 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo | 11-150-059 | |
| Oxygen regulator | Praxair | ||
| Oxygen tanks – | Praxair | ||
| Plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-48 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher | AC193780010 | |
| Printer Timing Belt | Amazon | https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/ | |
| Razor rectangle blades | Fisher | 12-640 | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Recombinant Human VEGF | R&D Systems | 293-VE-010/CF | |
| Retractable scalpels | Fisher | 22-079-716 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | AC217125000 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | AC327300010 | |
| Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7000 SMZ-2 | |
| Xylazine HCl (100 mg/mL) | Heartland Veterinary Supply | NADA 139-236 |
References
- Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature. BMC Medicine. 14, 10 (2016).
- Fermini, B., Fossa, A. A. The impact of drug-induced QT interval prolongation on drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (6), 439-447 (2003).
- Moslehi, J. J. Cardiovascular Toxic Effects of Targeted Cancer Therapies. The New England Journal of Medicine. 375 (15), 1457-1467 (2016).
- Robertson, C., Tran, D. D., George, S. C. Concise review: maturation phases of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 31 (5), 829-837 (2013).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigations. 128 (5), 2127-2143 (2018).
- Kretzschmar, K., et al. Profiling proliferative cells and their progeny in damaged murine hearts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (52), E12245-E12254 (2018).
- Perbellini, F., et al. Investigation of cardiac fibroblasts using myocardial slices. Cardiovascular Research. 114 (1), 77-89 (2018).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
- Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798 (2016).
- Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Jones, S. P., et al. The NHLBI-sponsored Consortium for preclinicAl assESsment of cARdioprotective therapies (CAESAR): a new paradigm for rigorous, accurate, and reproducible evaluation of putative infarct-sparing interventions in mice, rabbits, and pigs. Circulation Research. 116 (4), 572-586 (2015).
- Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. Journal of Anatomy. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 117 (2019).
- Franke, J., Abs, V., Zizzadoro, C., Abraham, G. Comparative study of the effects of fetal bovine serum versus horse serum on growth and differentiation of primary equine bronchial fibroblasts. BMC Veterinary Research. 10, 119 (2014).
- Vuorenpaa, H., et al. Novel in vitro cardiovascular constructs composed of vascular-like networks and cardiomyocytes. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 50 (4), 275-286 (2014).
- Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 139-150 (2018).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 2168 (2019).
