تصوير السرب البكتيري والاستجابة الجماعية للإجهاد
Summary
نحن بالتفصيل طريقة بسيطة لإنتاج أفلام عالية الدقة الفاصل الزمني من أسراب Pseudomonas aeruginosa التي تستجيب لbacteriophage (phage) والإجهاد المضادات الحيوية باستخدام ماسح ضوئي وثيقة مسطحة. هذا الإجراء هو طريقة سريعة وبسيطة لرصد ديناميات يحتشدون ويمكن تكييفها لدراسة حركية ونمو الأنواع البكتيرية الأخرى.
Abstract
يحتشدون هو شكل من أشكال حركية السطح لوحظ في العديد من الأنواع البكتيرية بما في ذلك Pseudomonas aeruginosa والإشريكية القولونية. هنا ، تتحرك مجموعات كثيفة من البكتيريا على مسافات كبيرة في مجتمعات مميزة على شكل وترلي على مدار ساعات. الدفء حساس لعدة عوامل بما في ذلك الرطوبة المتوسطة والرطوبة ومحتوى المغذيات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استجابة الإجهاد الجماعية ، التي لوحظت في P. aeruginosa التي يتم الضغط عليها من خلال المضادات الحيوية أو البكتيريا (phage) ، تصد أسراب من الاقتراب من المنطقة التي تحتوي على الإجهاد. وتتناول الأساليب الموصوفة هنا كيفية التحكم في العوامل الحرجة التي تؤثر على الاحترار. نقدم طريقة بسيطة لرصد الديناميكيات المحتشدة والاستجابة الجماعية للإجهاد بدقة زمنية عالية باستخدام ماسح ضوئي للمستندات المسطحة ، ووصف كيفية تجميع وإجراء تحليل كمي للأسراب. توفر هذه الطريقة البسيطة والفعالة من حيث التكلفة قياسًا كميًا دقيقًا وجيد التحكم فيه للاحترار ويمكن توسيعنطاقها لتشمل أنواعًا أخرى من المقالات النمو القائمة على الصفائح والأنواع البكتيرية.
Introduction
يحتشدون هو شكل جماعي من الحركة البكتيرية المنسقة التي تزيد من مقاومة المضادات الحيوية وإنتاج عوامل الفوعة في المضيف1،2،3. يحدث هذا السلوك متعدد الخلايا على الأسطح شبه الصلبة التي تشبه تلك الطبقات المخاطية التي تغطي الأغشية الظهارية في الرئتين4،5. يتم إنتاج المواد البيولوجية السطحية عادة من قبل السكان يحتشدون للتغلب على التوتر السطحي على الأسطح ويتم تنظيم إنتاج هذه من قبل أنظمة الإشارات الخلايا المعقدة، والمعروفة أيضا باسم استشعار النصاب6،7،8. العديد من أنواع البكتيريا قادرة على يحتشدون، بما في ذلك Pseudomonas aeruginosa، المكورات العنقودية أوريوس، والإشريكية القولونية9،10،11،12. الأنماط المحتشدة التي تخلقها البكتيريا متنوعة وتتأثر بالخصائص الفيزيائية والكيميائية للطبقة السطحية بما في ذلك تكوين المغذيات والمسامية والرطوبة13،14. بالإضافة إلى خصائص السطح، تؤثر درجة حرارة النمو والرطوبة المحيطة على عدة جوانب من الديناميكيات الدافئة، بما في ذلك معدل الاحترار والأنماط12،13،14،15. تخلق متغيرات النمو التي تؤثر على الاحترار تحديات تؤثر على قابلية الاستنساخ التجريبي والقدرة على تفسير النتائج. هنا ، نحن نصف طريقة موحدة بسيطة لمراقبة ديناميات أسراب البكتيريا من خلال التصوير الفاصل الزمني. تصف الطريقة كيفية التحكم في ظروف النمو الحرجة التي تؤثر بشكل كبير على تطور الاحترار. بالمقارنة مع الطرق التقليدية لتحليل سرب، وهذا الأسلوب التصوير الفاصل الزمني تمكن تتبع حركية أسراب متعددة في وقت واحد خلال فترات طويلة من الزمن ومع دقة عالية. وتحسن هذه الجوانب من عمق البيانات التي يمكن الحصول عليها من أسراب الرصد وتيسر تحديد العوامل التي تؤثر على الاحترار.
يسهل الاحترار في P. aeruginosa من خلال إنتاج وإطلاق الرهامنوبيدات و3-(3-هيدروكسي الكانويللوكسي) الأحماض الهلوليك فيالمنطقةالمحيطة 6,16. إن إدخال الإجهاد الناجم عن التركيزات شبه المميتة للمضادات الحيوية أو العدوى بفيروس الفاتج يؤثر على تنظيم الأسراب. على وجه الخصوص، هذه الضغوط تحفز P. aeruginosa لإطلاق جزيء استشعار النصاب 2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone، المعروف أيضا باسم إشارة الكينوالون السودوموناس (PQS)17،18. في المقايسات سرب التي تحتوي على مجموعتين من أسراب, PQS التي تنتجها السكان الناجمة عن الإجهاد يصد أسراب غير المعالجة من دخول المنطقة التي تحتوي على الإجهاد(الشكل 1). هذه الاستجابة الإجهاد الجماعي يشكل نظام إشارة الاتصالات الخطر الذي يحذر P. aeruginosa حول التهديدات القريبة18,19. آثار الإجهاد على P. aeruginosa، وتفعيل استجابة الإجهاد الجماعية ، وتنافر الأسراب يمكن تصورها باستخدام طريقة التصوير الفاصل الزمني الموصوفة هنا. يشرح البروتوكول الموصوف هنا كيفية: (1) إعداد لوحات أجار لليحتشّاب، (2) الثقافة P. aeruginosa لهذين النوعين من المقالات (المقالات التقليدية أو المقايسات الجماعية للاستجابة للإجهاد)(الشكل 1)،(3) الحصول على صور الفاصل الزمني، و(4) استخدام ImageJ لتجميع وتحليل الصور.
لفترة وجيزة، رصدت P. aeruginosa من ثقافة بين عشية وضحاها في منتصف لوحة أجار يحتشدون في حين رصدت P. aeruginosa التي يتم إصابة phage أو تعامل مع المضادات الحيوية في مواقع الأقمار الصناعية. يتم رصد تطور P. aeruginosa يحتشدون على ماسح ضوئي مسطح وثيقة المستهلك التي يتم وضعها في حاضنة 37 درجة مئوية تنظم الرطوبة. يتم التحكم في الماسح الضوئي من خلال برنامج يقوم تلقائيًا بمسح اللوحات على فترات منتظمة خلال فترة نمو السرب ، عادة ً ما تكون 16-20 ساعة. هذه الطريقة تسفر عن أشرطة الفيديو الفاصل الزمني المتزامنة تصل إلى ستة لوحات 10 سم يحتشدون. يتم تجميع الصور في أفلام ويتم قياس نفور الأسراب من قبل السكان الناجمعن الإجهاد باستخدام برنامج ImageJ المتاح بحرية. ويولى اهتمام خاص لضمان الاتساق والاستنساخ بين مختلف التجارب المحتشدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يركز هذا البروتوكول على تقليل التباين في لوحات الاجار المحتشدة وتوفير طريقة بسيطة ومنخفضة التكلفة للحصول على صور الفاصل الزمني لP. aeruginosa يحتشدون ويستجيبون للإجهاد. يمكن توسيع هذا الإجراء لتصوير الأنظمة البكتيرية الأخرى عن طريق تكييف تكوين الوسائط وظروف النمو. لP. aeruginosa، على الر?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ج.- ل.ب. كتب ونقح المخطوطة. صمم جميع المؤلفين التجارب. J.-L.B. أجرى التجارب والتحليلات. وقد تم دعم هذا العمل من قبل جائزة المعاهد القومية للصحة K22AI112816 وR21AI139968 منحة لA.S. ومن قبل جامعة كاليفورنيا. ن. م. هـ-ك. تم دعمه من قبل زمالات لوندبيك R220-2016-860 و R251-2017-1070. ولم يكن للممولين أي دور في قرار تقديم العمل للنشر. ليس لدينا مصالح متنافسة لنعلنها
Materials
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | For LB-agar plate and swarming agar plate |
| Casamino acids | BD Difco | 223050 | For swarming media |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose. For swarming media |
| Fosfomycin disodium salt | Tokyo Chemical Industry | F0889 | Stock concentration: 200 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| Gentamycin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Stock concentration: 3 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | Stock concentration: 100 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | For LB broth and LB-agar plates |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | For swarming media |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | For 5X M8 media |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For 5X M8 media |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | For 5X M8 media |
| Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | AFS27E.118 | PA14 strain |
| DMS3vir | O'Toole lab | DMS3vir20 | Bacteriophage |
| Supplies | |||
| Aluminium oxide sandpaper | 3M | 150 Fine | For black lids |
| Black fabric | Joann | PRD7089 | Black fabric |
| Black spray paint | Krylon | 5592 Matte Black | For black lids |
| Erlenmeyer flask | Kimax | 26500 | 250 mL |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| 8 inches zip ties | Gardner Bender | E173770 | For attaching black matte fabric |
| Petri dishes (100 mm x 15 mm) | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | For streaking and inoculating bacteria |
| Equipment | |||
| Autoclave | Market Forge Industries | STM-E | For sterilizing reagents |
| 25 mL pipette | USA Scientific, Inc. | 1072-5410 | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Dehumidifier | Frigidaire | FAD704DWD 70-pint | For maintaing room relative humidity at about 45% |
| ImageJ | NIH | v1.52a | Software for image analysis |
| Incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
| Laminar flow hood | The Baker Company | SG603A | For drying plates |
| P-20 pipet | Gilson | F123601 | Spotting on swarming agar plates |
| Pipette Controller | BrandTech | accu-jet | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Roller Drum | New Brunswick | TC-7 | For growth of bacteria at 100 rpm |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V370 Photo | Scanner for imaging plates |
| Scanner automation software | RoboTask Lite | v7.0.1.932 | For 30-min internals imaging |
| Scanner image acquisition software | Epson | v9.9.2.5US | Software for imaging plates |
References
- Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).
- Lai, S., Tremblay, J., Déziel, E. Swarming motility: a multicellular behaviour conferring antimicrobial resistance. Environmental Microbiology. 11 (1), 126-136 (2009).
- Overhage, J., Bains, M., Brazas, M. D., Hancock, R. E. W. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex adaptation leading to increased production of virulence factors and antibiotic resistance. Journal of Bacteriology. 190 (8), 2671-2679 (2008).
- Yeung, A. T. Y., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
- Girod, S., Zahm, J. M., Plotkowski, C., Beck, G., Puchelle, E. Role of the physiochemical properties of mucus in the protection of the respiratory epithelium. The European Respiratory Journal. 5 (4), 477-487 (1992).
- Caiazza, N. C., Shanks, R. M. Q., O’Toole, G. A. Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).
- Déziel, E., Lépine, F., Milot, S., Villemur, R. rhlA is required for the production of a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aeruginosa: 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids. Microbiology. 149, 2005-2013 (2003).
- Dusane, D. H., Zinjarde, S. S., Venugopalan, V. P., McLean, R. J. C., Weber, M. M., Rahman, P. K. S. M. Quorum sensing: implications on rhamnolipid biosurfactant production. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 27, 159-184 (2010).
- Köhler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pechère, J. C. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili. Journal of Bacteriology. 182 (21), 5990-5996 (2000).
- Pollitt, E. J. G., Crusz, S. A., Diggle, S. P. Staphylococcus aureus forms spreading dendrites that have characteristics of active motility. Scientific Reports. 5, 17698 (2015).
- Burkart, M., Toguchi, A., Harshey, R. M. The chemotaxis system, but not chemotaxis, is essential for swarming motility in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2568-2573 (1998).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Tremblay, J., Déziel, E. Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa swarming motility assays. Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
- Ha, D. -. G., Kuchma, S. L., O’Toole, G. A. Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa. Methods in Molecular Biology. 1149, 67-72 (2014).
- Tremblay, J., Richardson, A. -. P., Lépine, F., Déziel, E. Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour. Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).
- Morales-Soto, N., et al. Spatially dependent alkyl quinolone signaling responses to antibiotics in Pseudomonas aeruginosa swarms. The Journal of Biological Chemistry. 293 (24), 9544-9552 (2018).
- Bru, J. -. L., et al. PQS produced by the Pseudomonas aeruginosa stress response repels swarms away from bacteriophage and antibiotics. Journal of Bacteriology. , (2019).
- van Kessel, J. C. PQS signaling for more than a quorum: the collective stress response protects healthy Pseudomonas aeruginosa populations. Journal of Bacteriology. , (2019).
- Zegans, M. E., et al. Interaction between bacteriophage DMS3 and host CRISPR region inhibits group behaviors of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 191 (1), 210-219 (2009).
- Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa. PloS One. 6 (6), 20888 (2011).
- Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple Environmental Factors Influence the Importance of the Phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa Swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), (2018).
- Boyle, K. E., Monaco, H., van Ditmarsch, D., Deforet, M., Xavier, J. B. Integration of Metabolic and Quorum Sensing Signals Governing the Decision to Cooperate in a Bacterial Social Trait. PLoS computational biology. 11 (5), 10004279 (2015).
- Bernier, S. P., Ha, D. -. G., Khan, W., Merritt, J. H., O’Toole, G. A. Modulation of Pseudomonas aeruginosa surface-associated group behaviors by individual amino acids through c-di-GMP signaling. Research in Microbiology. 162 (7), 680-688 (2011).
