Zeitraffer-Bildgebung von Bakterienschwärmen und kollektive Stressreaktion
Summary
Wir beschreiben eine einfache Methode, um hochauflösende Zeitrafferfilme von Pseudomonas aeruginosa Schwärmen zu produzieren, die mit einem Flachbett-Dokumentenscanner auf Bakteriophage (Phagen) und Antibiotikastress reagieren. Dieses Verfahren ist eine schnelle und einfache Methode zur Überwachung der Schwärmedynamik und kann angepasst werden, um die Beweglichkeit und das Wachstum anderer Bakterienarten zu untersuchen.
Abstract
Schwärmen ist eine Form der Oberflächenbeweglichkeit, die bei vielen Bakterienarten wie Pseudomonas aeruginosa und Escherichia colibeobachtet wird. Hier bewegen sich dichte Bakterienpopulationen im Laufe der Stunden über große Entfernungen in charakteristischen rankenförmigen Gemeinschaften. Das Schwärmen ist empfindlich gegenüber mehreren Faktoren, einschließlich mittlerer Feuchtigkeit, Feuchtigkeit und Nährstoffgehalt. Darüber hinaus wehrt die kollektive Stressreaktion, die bei P. aeruginosa beobachtet wird, die durch Antibiotika oder Bakteriophagen (Phagen) gestresst sind, Schwärme ab, sich dem Bereich zu nähern, der den Stress enthält. Die hier beschriebenen Methoden befassen sich mit der Kontrolle der kritischen Faktoren, die das Schwärmen beeinflussen. Wir führen eine einfache Methode ein, um die Schwärmedynamik und die kollektive Stressreaktion mit hoher zeitlicher Auflösung mit einem Flachbett-Dokumentenscanner zu überwachen und zu beschreiben, wie eine quantitative Analyse von Schwärmen kompiliert und durchgeführt wird. Diese einfache und kostengünstige Methode ermöglicht eine präzise und gut kontrollierte Quantifizierung des Schwarms und kann auf andere Arten von plattenbasierten Wachstumstests und Bakterienarten ausgedehnt werden.
Introduction
Schwärmen ist eine kollektive Form der koordinierten bakteriellen Beweglichkeit, die Antibiotikaresistenz und Produktion von Virulenzfaktoren im Wirt1,2,3erhöht. Dieses multizelluläre Verhalten tritt auf halbfesten Oberflächen auf, die denen von Schleimschichten ähneln, die Epithelmembranen in der Lungeabdecken 4,5. Biosurfactants werden üblicherweise von Schwärmepopulationen produziert, um die Oberflächenspannung auf Oberflächen zu überwinden, und die Produktion dieser stoffe wird durch komplexe Zell-Zell-Signalsysteme reguliert, auch bekannt als Quorum-Sensing6,7,8. Viele Arten von Bakterien sind in der Lage zu schwärmen, einschließlich Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, und Escherichia coli9,10,11,12. Die von Bakterien erzeugten Schwarmmuster sind vielfältig und werden durch die physikalischen und chemischen Eigenschaften der Oberflächenschicht beeinflusst, einschließlich Nährstoffzusammensetzung, Porosität und Feuchtigkeit13,14. Neben den Oberflächeneigenschaften beeinflussen Wachstumstemperatur und Umgebungsfeuchtigkeit verschiedene Aspekte der Schwärmedynamik, einschließlich Schwarmrate und Muster12,13,14,15. Die Wachstumsvariablen, die das Schwärmen beeinflussen, schaffen Herausforderungen, die sich auf die experimentelle Reproduzierbarkeit und die Fähigkeit zur Interpretation von Ergebnissen auswirken. Hier beschreiben wir eine einfache standardisierte Methode, um die Dynamik von Bakterienschwärmen durch Zeitraffer-Bildgebung zu überwachen. Die Methode beschreibt, wie kritische Wachstumsbedingungen gesteuert werden können, die das Fortschreiten des Schwärmens erheblich beeinflussen. Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden der Schwarmanalyse ermöglicht diese Zeitraffer-Bildgebungsmethode die gleichzeitige Verfolgung der Beweglichkeit mehrerer Schwärme während längerer Zeiträume und mit hoher Auflösung. Diese Aspekte verbessern die Tiefe der Daten, die durch die Überwachung von Schwärmen gewonnen werden können, und erleichtern die Identifizierung von Faktoren, die das Schwärmen beeinflussen.
Das Schwärmen in P. aeruginosa wird durch die Herstellung und Freisetzung von Rhamnolipiden und 3-(3-Hydroxyalkanoyloxy)alkanoic Säuren in die Umgebung 66,16erleichtert. Die Einführung von Stress aus subtödlichen Konzentrationen von Antibiotika oder Infektionen durch Phagenviren wirkt sich auf die Organisation von Schwärmen aus. Insbesondere veranlassen diese Spannungen P. aeruginosa, das Quorum-Sensing-Molekül 2-Heptyl-3-hydroxy-4-chinolon, auch bekannt als Pseudomonas-Chinolonsignal (PQS)17,18,freizusetzen. In Schwarm-Assays, die zwei Populationen von Schwärmen enthalten, wehrt PQS, die von der stressinduzierten Population produziert werden, unbehandelte Schwärme ab, die in das Gebiet eindringen, das den Stress enthält (Abbildung 1). Diese kollektive Stressreaktion stellt ein Gefahrenkommunikationssignalsystem dar, das P. aeruginosa vor nahegelegenen Bedrohungen warnt18,19. Die Auswirkungen von Stress auf P. aeruginosa, die Aktivierung der kollektiven Stressreaktion und die Abstoßung von Schwärmen können mit der hier beschriebenen Zeitraffer-Bildgebungsmethode visualisiert werden. Das hier beschriebene Protokoll erklärt, wie: (1) Agarplatten für schwärmen, (2) Kultur P. aeruginosa für zwei Arten von Assays (traditionelle Schwarm-Assays oder kollektive Stressreaktions-Assays) (Abbildung 1), (3) Zeitrafferbilder erfassen und (4) ImageJ zum Kompilieren und Analysieren der Bilder verwenden.
Kurz gesagt, P. aeruginosa aus einer Nachtkultur wird in der Mitte einer schwärmenden Agarplatte gesichtet, während P. aeruginosa, die mit Phagen infiziert oder mit Antibiotika behandelt werden, an den Satellitenpositionen gesichtet werden. Das Fortschreiten des P. aeruginosa-Schwarms wird auf einem Verbraucherdokument-Flachbettscanner überwacht, der in einem feuchtigkeitsregulierten 37 °C-Inkubator platziert wird. Der Scanner wird von einer Software gesteuert, die die Platten in regelmäßigen Abständen über die Schwarmwachstumsphase, in der Regel 16 bis 20 H, automatisch scannt. Diese Methode liefert gleichzeitige Zeitraffervideos von bis zu sechs 10 cm Schwarmplatten. Die Bilder werden in Filmen zusammengestellt und die Abstoßung von Schwärmen durch stressinduzierte Populationen wird mit frei verfügbarer ImageJ-Software quantifiziert. Besondere Aufmerksamkeit wird der Gewährleistung der Konsistenz und Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Schwarmexperimenten gewidmet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Minimierung der Variabilität in Schwärmen von Agarplatten und die Bereitstellung einer einfachen und kostengünstigen Methode, um Zeitrafferbilder von P. aeruginosa zu erfassen, die schwärmen und auf Stress reagieren. Dieses Verfahren kann durch Anpassung der Medienzusammensetzung und der Wachstumsbedingungen auf andere Bakterielle Systeme erweitert werden. Für P. aeruginosa, obwohl M9 oder FAB minimales Medium verwendet werden kann, um Schwärme<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.-L.B., A.S., und N.M.H-K. das Manuskript geschrieben und überarbeitet. Alle Autoren haben die Experimente entworfen. J.-L.B. führte die Experimente und Analysen durch. Diese Arbeit wurde durch den NIH Award K22AI112816 und R21AI139968 Stipendium an A.S. und die University of California unterstützt. N.M.H-K. wurde unterstützt von den Lundbeck Fellowships R220-2016-860 und R251-2017-1070. Die Geldgeber spielten bei der Entscheidung, das Werk zur Veröffentlichung einzureichen, keine Rolle. Wir haben keine konkurrierenden Interessen zu erklären.
Materials
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | For LB-agar plate and swarming agar plate |
| Casamino acids | BD Difco | 223050 | For swarming media |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose. For swarming media |
| Fosfomycin disodium salt | Tokyo Chemical Industry | F0889 | Stock concentration: 200 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| Gentamycin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Stock concentration: 3 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | Stock concentration: 100 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | For LB broth and LB-agar plates |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | For swarming media |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | For 5X M8 media |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For 5X M8 media |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | For 5X M8 media |
| Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | AFS27E.118 | PA14 strain |
| DMS3vir | O'Toole lab | DMS3vir20 | Bacteriophage |
| Supplies | |||
| Aluminium oxide sandpaper | 3M | 150 Fine | For black lids |
| Black fabric | Joann | PRD7089 | Black fabric |
| Black spray paint | Krylon | 5592 Matte Black | For black lids |
| Erlenmeyer flask | Kimax | 26500 | 250 mL |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| 8 inches zip ties | Gardner Bender | E173770 | For attaching black matte fabric |
| Petri dishes (100 mm x 15 mm) | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | For streaking and inoculating bacteria |
| Equipment | |||
| Autoclave | Market Forge Industries | STM-E | For sterilizing reagents |
| 25 mL pipette | USA Scientific, Inc. | 1072-5410 | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Dehumidifier | Frigidaire | FAD704DWD 70-pint | For maintaing room relative humidity at about 45% |
| ImageJ | NIH | v1.52a | Software for image analysis |
| Incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
| Laminar flow hood | The Baker Company | SG603A | For drying plates |
| P-20 pipet | Gilson | F123601 | Spotting on swarming agar plates |
| Pipette Controller | BrandTech | accu-jet | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Roller Drum | New Brunswick | TC-7 | For growth of bacteria at 100 rpm |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V370 Photo | Scanner for imaging plates |
| Scanner automation software | RoboTask Lite | v7.0.1.932 | For 30-min internals imaging |
| Scanner image acquisition software | Epson | v9.9.2.5US | Software for imaging plates |
References
- Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).
- Lai, S., Tremblay, J., Déziel, E. Swarming motility: a multicellular behaviour conferring antimicrobial resistance. Environmental Microbiology. 11 (1), 126-136 (2009).
- Overhage, J., Bains, M., Brazas, M. D., Hancock, R. E. W. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex adaptation leading to increased production of virulence factors and antibiotic resistance. Journal of Bacteriology. 190 (8), 2671-2679 (2008).
- Yeung, A. T. Y., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
- Girod, S., Zahm, J. M., Plotkowski, C., Beck, G., Puchelle, E. Role of the physiochemical properties of mucus in the protection of the respiratory epithelium. The European Respiratory Journal. 5 (4), 477-487 (1992).
- Caiazza, N. C., Shanks, R. M. Q., O’Toole, G. A. Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).
- Déziel, E., Lépine, F., Milot, S., Villemur, R. rhlA is required for the production of a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aeruginosa: 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids. Microbiology. 149, 2005-2013 (2003).
- Dusane, D. H., Zinjarde, S. S., Venugopalan, V. P., McLean, R. J. C., Weber, M. M., Rahman, P. K. S. M. Quorum sensing: implications on rhamnolipid biosurfactant production. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 27, 159-184 (2010).
- Köhler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pechère, J. C. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili. Journal of Bacteriology. 182 (21), 5990-5996 (2000).
- Pollitt, E. J. G., Crusz, S. A., Diggle, S. P. Staphylococcus aureus forms spreading dendrites that have characteristics of active motility. Scientific Reports. 5, 17698 (2015).
- Burkart, M., Toguchi, A., Harshey, R. M. The chemotaxis system, but not chemotaxis, is essential for swarming motility in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2568-2573 (1998).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Tremblay, J., Déziel, E. Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa swarming motility assays. Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
- Ha, D. -. G., Kuchma, S. L., O’Toole, G. A. Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa. Methods in Molecular Biology. 1149, 67-72 (2014).
- Tremblay, J., Richardson, A. -. P., Lépine, F., Déziel, E. Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour. Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).
- Morales-Soto, N., et al. Spatially dependent alkyl quinolone signaling responses to antibiotics in Pseudomonas aeruginosa swarms. The Journal of Biological Chemistry. 293 (24), 9544-9552 (2018).
- Bru, J. -. L., et al. PQS produced by the Pseudomonas aeruginosa stress response repels swarms away from bacteriophage and antibiotics. Journal of Bacteriology. , (2019).
- van Kessel, J. C. PQS signaling for more than a quorum: the collective stress response protects healthy Pseudomonas aeruginosa populations. Journal of Bacteriology. , (2019).
- Zegans, M. E., et al. Interaction between bacteriophage DMS3 and host CRISPR region inhibits group behaviors of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 191 (1), 210-219 (2009).
- Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa. PloS One. 6 (6), 20888 (2011).
- Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple Environmental Factors Influence the Importance of the Phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa Swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), (2018).
- Boyle, K. E., Monaco, H., van Ditmarsch, D., Deforet, M., Xavier, J. B. Integration of Metabolic and Quorum Sensing Signals Governing the Decision to Cooperate in a Bacterial Social Trait. PLoS computational biology. 11 (5), 10004279 (2015).
- Bernier, S. P., Ha, D. -. G., Khan, W., Merritt, J. H., O’Toole, G. A. Modulation of Pseudomonas aeruginosa surface-associated group behaviors by individual amino acids through c-di-GMP signaling. Research in Microbiology. 162 (7), 680-688 (2011).
