Bakteriyel Sürülerin Hızlandırılmış Görüntülemesi ve Kolektif Stres Tepkisi
Summary
Biz psödomonas aeruginosa sürüleri bakteriyofaj (faj) ve antibiyotik stres bir flatbed belge tarayıcı kullanarak yanıt yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı filmler üretmek için basit bir yöntem detay. Bu prosedür, sürü dinamiklerini izlemek için hızlı ve basit bir yöntemdir ve diğer bakteri türlerinin hareketliliğini ve büyümesini incelemek için uyarlanabilir.
Abstract
Swarming Pseudomonas aeruginosa ve Escherichia colidahil olmak üzere birçok bakteri türlerinde gözlenen yüzey hareketliliği bir şeklidir. Burada, yoğun bakteri popülasyonları, saat boyunca karakteristik tendril şekilli topluluklarda büyük mesafeler boyunca hareket eder. Swarming orta nem, nem ve besin içeriği de dahil olmak üzere çeşitli faktörlere duyarlıdır. Buna ek olarak, antibiyotik veya bakteriyofaj (faj) tarafından stresli P. aeruginosa gözlenen kolektif stres yanıtı, stres içeren alana yaklaşan sürüleri iter. Burada açıklanan yöntemler, sürücürün nasıl kontrol altına alınabildiğini ele adamaktadır. Düz yataklı belge tarayıcısı kullanarak sürü dinamiklerini ve kolektif stres tepkisini yüksek zamansal çözünürlükle izlemek ve sürülerin nicel analizini nasıl derleyip gerçekleştirebileceğimizi açıklamak için basit bir yöntem sıyoruz. Bu basit ve uygun maliyetli yöntem, sürünün hassas ve iyi kontrollü bir şekilde ölçülmesini sağlar ve diğer plaka bazlı büyüme tahlillerine ve bakteri türlerine de genişletilebilir.
Introduction
Swarming antibiyotik direnci ve ev sahibi1virülans faktörlerin üretimini artırır koordine bakteriyel hareketlilik kolektif bir şeklidir1 ,2,3. Bu çok hücreli davranış akciğerlerde epitel zarları kapsayan mukoza katmanları benzer yarı katı yüzeylerde oluşur4,5. Biyosürfamaddeler genellikle yüzeylerde yüzey gerilimi aşmak için kalabalık popülasyonlar tarafından üretilen ve bunların üretimi karmaşık hücre-hücre sinyal sistemleri tarafından düzenlenir, ayrıca çoğunluk algılama olarak bilinen6,7,8. Bakteri birçok tür sürü yeteneğine sahiptir, Pseudomonas aeruginosadahil, Staphylococcus aureus, ve Escherichia coli9,10,11,12. Bakteriler tarafından oluşturulan sürü desenleri çeşitlidir ve besin bileşimi, gözeneklilik ve nem13,14dahil olmak üzere yüzey tabakasının fiziksel ve kimyasal özelliklerinden etkilenir. Yüzey özelliklerine ek olarak, büyüme sıcaklığı ve ortam nemi sürü dinamiği çeşitli yönlerini etkiler, swarming oranı ve desenleri de dahil olmak üzere12,13,14,15. Sürüleri etkileyen büyüme değişkenleri, deneysel tekrarlanabilirliği ve sonuçları yorumlama yeteneğini etkileyen zorluklar yaratır. Burada, zaman atlamalı görüntüleme yoluyla bakteri sürülerinin dinamiklerini izlemek için basit bir standart yöntemi tanımlıyoruz. Yöntem, swarming ilerlemesini önemli ölçüde etkileyen kritik büyüme koşullarının nasıl kontrol edilebildiğini açıklar. Geleneksel sürü analizi yöntemleriyle karşılaştırıldığında, bu hızlandırılmış görüntüleme yöntemi, uzun süreler boyunca ve yüksek çözünürlükte aynı anda birden fazla sürünün hareketliliğini izlemeyi sağlar. Bu hususlar, sürülerin izlenmesinden elde edilebilen verilerin derinliğini artırır ve sürüleri etkileyen faktörlerin belirlenmesini kolaylaştırır.
P. aeruginosa swarming üretimi ve rhamnolipidler ve 3-(3-hidroksyalkanoyloxy) alkanoik asitlerinçevreye,6,16salınımı ile kolaylaştırılır. Faj virüsü ile antibiyotik veya enfeksiyon alt öldürücü konsantrasyonları stres giriş sürüleri organizasyonu etkiler. Özellikle, Bu stresler P. aeruginosa prosing molekül 2-heptyl-3-hidroksi-4-kinolon, ayrıca Pseudomonas quinolone sinyal (PQS) 17 olarak bilinen serbest bırakmak için neden17,18. İki sürü popülasyonu içeren sürü tahlillerinde, strese bağlı popülasyon tarafından üretilen PQS, işlenmemiş sürüleri stres içeren alana girmekten uzaklaştırır(Şekil 1). Bu toplu stres tepkisi yakındaki tehditler hakkında P. aeruginosa uyarır bir tehlike iletişim sinyal sistemi oluşturur18,19. P. aeruginosaüzerinde stresin etkileri , kolektif stres yanıtı aktivasyonu, ve sürülerin itme burada açıklanan hızlandırılmış görüntüleme yöntemi kullanılarak görselleştirilebilir. Burada açıklanan protokol nasıl açıklanabilir: (1) swarming için agar plakaları hazırlamak, (2) kültür P. aeruginosa tahliller iki tür (geleneksel swarming tahliller veya toplu stres tepkisi tahlilleri) (Şekil 1), (3) zaman atlamalı görüntüleri elde, ve (4) görüntüleri derlemek ve analiz etmek için ImageJ kullanın.
Kısaca, P. aeruginosa bir gecede kültürden bir sürü agar plaka ortasında tespit edilirken P. aeruginosa faj ile enfekte veya antibiyotik ile tedavi uydu pozisyonlarında tespit edilir. P. aeruginosa sürüsünün ilerlemesi, nem le ilgili 37 °C inkübatöre yerleştirilen bir tüketici belgesi nde yassı bir tarayıcıda izlenir. Tarayıcı, genellikle 16-20 saat boyunca, düzenli aralıklarla plakaları tarayan bir yazılım tarafından kontrol edilir. Bu yöntem, altı 10 cm’ye kadar sürühalinde eşzamanlı zaman atlamalı videolar verir. Görüntüler filmlerhalinde derlenir ve sürülerin strese bağlı popülasyonlar tarafından itilmesi serbestçe kullanılabilir ImageJ yazılımı kullanılarak ölçülür. Farklı sürü deneyleri arasında tutarlılık ve tekrarlanabilirlik sağlamak için özel önem verilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, agar plakaları sürühalindeki değişkenliği en aza indirmeye ve P. aeruginosa swarming ve strese yanıt veren hızlandırılmış görüntüleri elde etmek için basit ve düşük maliyetli bir yöntem sağlamaya odaklanır. Bu prosedür, ortam kompozisyonu ve büyüme koşulları uyarlayarak görüntü diğer bakteri sistemleri uzatılabilir. P. aeruginosaiçin , Her ne kadar M9 veya FAB minimal orta sürücünü ikna etmek için kullanılabilir16,<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.-L.B., A.S., ve N.M.H-K. taslağı yazdı ve gözden geçirdi. Deneyleri tüm yazarlar tasarladı. J.-L.B. deneyleri ve analizleri yaptı. Bu çalışma NIH ödülü K22AI112816 ve R21AI139968 a.s. ve University of California tarafından desteklenmiştir. N.M.H-K. Lundbeck Bursları R220-2016-860 ve R251-2017-1070 tarafından desteklenmiştir. Fon, eserin yayına sunulması kararında hiçbir rol sahip değillerdi. Beyan etmek için rekabet eden bir çıkarımız yok.
Materials
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | For LB-agar plate and swarming agar plate |
| Casamino acids | BD Difco | 223050 | For swarming media |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose. For swarming media |
| Fosfomycin disodium salt | Tokyo Chemical Industry | F0889 | Stock concentration: 200 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| Gentamycin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Stock concentration: 3 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | Stock concentration: 100 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | For LB broth and LB-agar plates |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | For swarming media |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | For 5X M8 media |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For 5X M8 media |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | For 5X M8 media |
| Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | AFS27E.118 | PA14 strain |
| DMS3vir | O'Toole lab | DMS3vir20 | Bacteriophage |
| Supplies | |||
| Aluminium oxide sandpaper | 3M | 150 Fine | For black lids |
| Black fabric | Joann | PRD7089 | Black fabric |
| Black spray paint | Krylon | 5592 Matte Black | For black lids |
| Erlenmeyer flask | Kimax | 26500 | 250 mL |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| 8 inches zip ties | Gardner Bender | E173770 | For attaching black matte fabric |
| Petri dishes (100 mm x 15 mm) | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | For streaking and inoculating bacteria |
| Equipment | |||
| Autoclave | Market Forge Industries | STM-E | For sterilizing reagents |
| 25 mL pipette | USA Scientific, Inc. | 1072-5410 | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Dehumidifier | Frigidaire | FAD704DWD 70-pint | For maintaing room relative humidity at about 45% |
| ImageJ | NIH | v1.52a | Software for image analysis |
| Incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
| Laminar flow hood | The Baker Company | SG603A | For drying plates |
| P-20 pipet | Gilson | F123601 | Spotting on swarming agar plates |
| Pipette Controller | BrandTech | accu-jet | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Roller Drum | New Brunswick | TC-7 | For growth of bacteria at 100 rpm |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V370 Photo | Scanner for imaging plates |
| Scanner automation software | RoboTask Lite | v7.0.1.932 | For 30-min internals imaging |
| Scanner image acquisition software | Epson | v9.9.2.5US | Software for imaging plates |
References
- Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).
- Lai, S., Tremblay, J., Déziel, E. Swarming motility: a multicellular behaviour conferring antimicrobial resistance. Environmental Microbiology. 11 (1), 126-136 (2009).
- Overhage, J., Bains, M., Brazas, M. D., Hancock, R. E. W. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex adaptation leading to increased production of virulence factors and antibiotic resistance. Journal of Bacteriology. 190 (8), 2671-2679 (2008).
- Yeung, A. T. Y., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
- Girod, S., Zahm, J. M., Plotkowski, C., Beck, G., Puchelle, E. Role of the physiochemical properties of mucus in the protection of the respiratory epithelium. The European Respiratory Journal. 5 (4), 477-487 (1992).
- Caiazza, N. C., Shanks, R. M. Q., O’Toole, G. A. Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).
- Déziel, E., Lépine, F., Milot, S., Villemur, R. rhlA is required for the production of a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aeruginosa: 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids. Microbiology. 149, 2005-2013 (2003).
- Dusane, D. H., Zinjarde, S. S., Venugopalan, V. P., McLean, R. J. C., Weber, M. M., Rahman, P. K. S. M. Quorum sensing: implications on rhamnolipid biosurfactant production. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 27, 159-184 (2010).
- Köhler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pechère, J. C. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili. Journal of Bacteriology. 182 (21), 5990-5996 (2000).
- Pollitt, E. J. G., Crusz, S. A., Diggle, S. P. Staphylococcus aureus forms spreading dendrites that have characteristics of active motility. Scientific Reports. 5, 17698 (2015).
- Burkart, M., Toguchi, A., Harshey, R. M. The chemotaxis system, but not chemotaxis, is essential for swarming motility in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2568-2573 (1998).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Tremblay, J., Déziel, E. Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa swarming motility assays. Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
- Ha, D. -. G., Kuchma, S. L., O’Toole, G. A. Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa. Methods in Molecular Biology. 1149, 67-72 (2014).
- Tremblay, J., Richardson, A. -. P., Lépine, F., Déziel, E. Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour. Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).
- Morales-Soto, N., et al. Spatially dependent alkyl quinolone signaling responses to antibiotics in Pseudomonas aeruginosa swarms. The Journal of Biological Chemistry. 293 (24), 9544-9552 (2018).
- Bru, J. -. L., et al. PQS produced by the Pseudomonas aeruginosa stress response repels swarms away from bacteriophage and antibiotics. Journal of Bacteriology. , (2019).
- van Kessel, J. C. PQS signaling for more than a quorum: the collective stress response protects healthy Pseudomonas aeruginosa populations. Journal of Bacteriology. , (2019).
- Zegans, M. E., et al. Interaction between bacteriophage DMS3 and host CRISPR region inhibits group behaviors of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 191 (1), 210-219 (2009).
- Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa. PloS One. 6 (6), 20888 (2011).
- Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple Environmental Factors Influence the Importance of the Phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa Swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), (2018).
- Boyle, K. E., Monaco, H., van Ditmarsch, D., Deforet, M., Xavier, J. B. Integration of Metabolic and Quorum Sensing Signals Governing the Decision to Cooperate in a Bacterial Social Trait. PLoS computational biology. 11 (5), 10004279 (2015).
- Bernier, S. P., Ha, D. -. G., Khan, W., Merritt, J. H., O’Toole, G. A. Modulation of Pseudomonas aeruginosa surface-associated group behaviors by individual amino acids through c-di-GMP signaling. Research in Microbiology. 162 (7), 680-688 (2011).
