Time-lapse Beeldvorming van bacteriële zwermen en de Collectieve Stress Response
Summary
We detaileen eenvoudige methode om hoge resolutie time-lapse films van Pseudomonas aeruginosa zwermen die reageren op bacteriofaag (faag) en antibiotica stress met behulp van een flatbed document scanner te produceren. Deze procedure is een snelle en eenvoudige methode voor het monitoren van zwermdynamiek en kan worden aangepast aan de beweeglijkheid en groei van andere bacteriesoorten.
Abstract
Zwermen is een vorm van oppervlakte beweeglijkheid waargenomen bij veel bacteriële soorten, waaronder Pseudomonas aeruginosa en Escherichia coli. Hier, dichte populaties van bacteriën bewegen zich over grote afstanden in karakteristieke rank-vormige gemeenschappen in de loop van uren. Zwermen is gevoelig voor verschillende factoren, waaronder medium vocht, vochtigheid, en het gehalte aan voedingsstoffen. Bovendien weerhoudt de collectieve stressrespons, die wordt waargenomen in P. aeruginosa die wordt benadrukt door antibiotica of bacteriofaag (faag), zwermen van het naderen van het gebied met de stress. De hier beschreven methoden gaan over hoe de kritische factoren die van invloed zijn op de zwermen te controleren. We introduceren een eenvoudige methode om de zwermdynamiek en de collectieve stressrespons met hoge temporele resolutie te monitoren met behulp van een flatbeddocumentscanner, en beschrijven hoe u een kwantitatieve analyse van zwermen compileren en uitvoeren. Deze eenvoudige en kosteneffectieve methode zorgt voor nauwkeurige en goed gecontroleerde kwantificering van zwermen en kan worden uitgebreid tot andere soorten op platen gebaseerde groeitesten en bacteriële soorten.
Introduction
Zwermen is een collectieve vorm van gecoördineerde bacteriële beweeglijkheid die de antibioticaresistentie en de productie van virulentiefactoren in gastheer1verhoogt ,2,3. Dit meercellige gedrag vindt plaats op semi-vaste oppervlakken die lijken op die van slijmlagen die epitheelmembranen in de longen4,5. Biosurfactants worden vaak geproduceerd door zwermpopulaties om de oppervlaktespanning op oppervlakken te overwinnen en de productie hiervan wordt gereguleerd door complexe celcelsignaleringssystemen, ook wel quorumdetectie6,7,8genoemd . Veel soorten bacteriën kunnen zwermen, waaronder Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, en Escherichia coli9,10,11,12. De zwermpatronen die door bacteriën worden gecreëerd, zijn divers en worden beïnvloed door de fysische en chemische eigenschappen van de oppervlaktelaag, waaronder de samenstelling van voedingsstoffen, porositeit en vocht13,14. Naast oppervlakte-eigenschappen beïnvloeden de groeitemperatuur en de luchtvochtigheid verschillende aspecten van de zwermdynamiek, waaronder zwermsnelheid en patronen12,13,14,15. De groeivariabelen die van invloed zijn op de zwermen creëren uitdagingen die de experimentele reproduceerbaarheid en het vermogen om resultaten te interpreteren beïnvloeden. Hier beschrijven we een eenvoudige gestandaardiseerde methode om de dynamiek van bacteriële zwermen te monitoren door middel van time-lapse beeldvorming. De methode beschrijft hoe kritieke groeiomstandigheden die de progressie van zwermen aanzienlijk beïnvloeden, kunnen worden onder controle. Vergeleken met traditionele methoden van zwermanalyse, maakt deze time-lapse imaging methode het mogelijk om de beweeglijkheid van meerdere zwermen gelijktijdig te volgen tijdens langere perioden en met hoge resolutie. Deze aspecten verbeteren de diepte van de gegevens die kunnen worden verkregen uit monitoring zwermen en vergemakkelijken de identificatie van factoren die van invloed zijn zwermen.
Zwermen in P. aeruginosa wordt vergemakkelijkt door de productie en afgifte van rhamnolipiden en 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic zuren in de omgeving6,16. De introductie van stress door sub-dodelijke concentraties van antibiotica of infectie door faagvirus heeft gevolgen voor de organisatie van zwermen. In het bijzonder leiden deze spanningen ertoe dat P. aeruginosa het quorumdetectiemolecuul 2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolon vrijgeeft, ook wel bekend als het Pseudomonas quinolone signaal (PQS)17,18. In zwermtesten die twee populaties zwermen bevatten, pqs geproduceerd door de stress-geïnduceerde bevolking afstoot onbehandelde zwermen van het invoeren van het gebied met de stress (Figuur 1). Deze collectieve stressrespons vormt een signaalsysteem voor gevaarcommunicatie dat P. aeruginosa waarschuwt voor bedreigingen in de buurt18,19. De effecten van stress op P. aeruginosa, de activering van de collectieve stressrespons en de afstoting van zwermen kunnen worden gevisualiseerd met behulp van de time-lapse beeldvormingsmethode die hier wordt beschreven. Het protocol dat hier wordt beschreven legt uit hoe: (1) agarplaten voorbereiden op zwermen, (2) cultuur P. aeruginosa voor twee soorten tests (traditionele zwermen de assays of collectieve stressresponstesten) (Figuur 1), (3) verkrijg time-lapse beelden, en (4) imagej gebruiken om de beelden samen te stellen en te analyseren.
Kortom, P. aeruginosa uit een nachtelijke cultuur wordt gespot in het midden van een zwermen agar plaat, terwijl P. aeruginosa die besmet zijn met faag of behandeld met antibiotica worden gespot op de satelliet posities. De progressie van P. aeruginosa zwermen wordt gecontroleerd op een consumentendocument flatbed scanner die wordt geplaatst in een vochtigheid geregeld37 °C incubator. De scanner wordt aangestuurd door een software die automatisch scant de platen op regelmatige tijdstippen over de zwerm groeiperiode, meestal 16-20 uur. Deze methode levert gelijktijdige time-lapse video’s op van maximaal zes 10 cm zwermplaten. De beelden worden gecompileerd in films en de afstoting van zwermen door stress-geïnduceerde populaties wordt gekwantificeerd met behulp van vrij beschikbare ImageJ software. Er wordt speciale aandacht besteed aan de consistentie en reproduceerbaarheid tussen de verschillende zwermexperimenten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol richt zich op het minimaliseren van de variabiliteit in zwermen agar platen en het verstrekken van een eenvoudige en low-cost methode om time-lapse beelden van P. aeruginosa zwermen en reageren op stress te verwerven. Deze procedure kan worden uitgebreid tot het beeld van andere bacteriële systemen door het aanpassen van de media samenstelling en groeivoorwaarden. Voor P. aeruginosa, hoewel M9 of FAB minimaal medium kan worden gebruikt om zwermen te induceren16…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.-L.B., A.S., en N.M.H-K. schreef en herzag het manuscript. Alle auteurs ontwierpen de experimenten. J.-L.B. voerde de experimenten en analyses uit. Dit werk werd ondersteund door de NIH award K22AI112816 en R21AI139968 subsidie aan A.S. en door de Universiteit van Californië. N.M.H-K. werd ondersteund door Lundbeck Fellowships R220-2016-860 en R251-2017-1070. De financiers hadden geen rol in het besluit om het werk voor publicatie in te dienen. We hebben geen concurrerende belangen te verklaren.
Materials
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | For LB-agar plate and swarming agar plate |
| Casamino acids | BD Difco | 223050 | For swarming media |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose. For swarming media |
| Fosfomycin disodium salt | Tokyo Chemical Industry | F0889 | Stock concentration: 200 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| Gentamycin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Stock concentration: 3 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | Stock concentration: 100 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | For LB broth and LB-agar plates |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | For swarming media |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | For 5X M8 media |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For 5X M8 media |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | For 5X M8 media |
| Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | AFS27E.118 | PA14 strain |
| DMS3vir | O'Toole lab | DMS3vir20 | Bacteriophage |
| Supplies | |||
| Aluminium oxide sandpaper | 3M | 150 Fine | For black lids |
| Black fabric | Joann | PRD7089 | Black fabric |
| Black spray paint | Krylon | 5592 Matte Black | For black lids |
| Erlenmeyer flask | Kimax | 26500 | 250 mL |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| 8 inches zip ties | Gardner Bender | E173770 | For attaching black matte fabric |
| Petri dishes (100 mm x 15 mm) | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | For streaking and inoculating bacteria |
| Equipment | |||
| Autoclave | Market Forge Industries | STM-E | For sterilizing reagents |
| 25 mL pipette | USA Scientific, Inc. | 1072-5410 | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Dehumidifier | Frigidaire | FAD704DWD 70-pint | For maintaing room relative humidity at about 45% |
| ImageJ | NIH | v1.52a | Software for image analysis |
| Incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
| Laminar flow hood | The Baker Company | SG603A | For drying plates |
| P-20 pipet | Gilson | F123601 | Spotting on swarming agar plates |
| Pipette Controller | BrandTech | accu-jet | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Roller Drum | New Brunswick | TC-7 | For growth of bacteria at 100 rpm |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V370 Photo | Scanner for imaging plates |
| Scanner automation software | RoboTask Lite | v7.0.1.932 | For 30-min internals imaging |
| Scanner image acquisition software | Epson | v9.9.2.5US | Software for imaging plates |
References
- Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).
- Lai, S., Tremblay, J., Déziel, E. Swarming motility: a multicellular behaviour conferring antimicrobial resistance. Environmental Microbiology. 11 (1), 126-136 (2009).
- Overhage, J., Bains, M., Brazas, M. D., Hancock, R. E. W. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex adaptation leading to increased production of virulence factors and antibiotic resistance. Journal of Bacteriology. 190 (8), 2671-2679 (2008).
- Yeung, A. T. Y., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
- Girod, S., Zahm, J. M., Plotkowski, C., Beck, G., Puchelle, E. Role of the physiochemical properties of mucus in the protection of the respiratory epithelium. The European Respiratory Journal. 5 (4), 477-487 (1992).
- Caiazza, N. C., Shanks, R. M. Q., O’Toole, G. A. Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).
- Déziel, E., Lépine, F., Milot, S., Villemur, R. rhlA is required for the production of a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aeruginosa: 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids. Microbiology. 149, 2005-2013 (2003).
- Dusane, D. H., Zinjarde, S. S., Venugopalan, V. P., McLean, R. J. C., Weber, M. M., Rahman, P. K. S. M. Quorum sensing: implications on rhamnolipid biosurfactant production. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 27, 159-184 (2010).
- Köhler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pechère, J. C. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili. Journal of Bacteriology. 182 (21), 5990-5996 (2000).
- Pollitt, E. J. G., Crusz, S. A., Diggle, S. P. Staphylococcus aureus forms spreading dendrites that have characteristics of active motility. Scientific Reports. 5, 17698 (2015).
- Burkart, M., Toguchi, A., Harshey, R. M. The chemotaxis system, but not chemotaxis, is essential for swarming motility in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2568-2573 (1998).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Tremblay, J., Déziel, E. Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa swarming motility assays. Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
- Ha, D. -. G., Kuchma, S. L., O’Toole, G. A. Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa. Methods in Molecular Biology. 1149, 67-72 (2014).
- Tremblay, J., Richardson, A. -. P., Lépine, F., Déziel, E. Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour. Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).
- Morales-Soto, N., et al. Spatially dependent alkyl quinolone signaling responses to antibiotics in Pseudomonas aeruginosa swarms. The Journal of Biological Chemistry. 293 (24), 9544-9552 (2018).
- Bru, J. -. L., et al. PQS produced by the Pseudomonas aeruginosa stress response repels swarms away from bacteriophage and antibiotics. Journal of Bacteriology. , (2019).
- van Kessel, J. C. PQS signaling for more than a quorum: the collective stress response protects healthy Pseudomonas aeruginosa populations. Journal of Bacteriology. , (2019).
- Zegans, M. E., et al. Interaction between bacteriophage DMS3 and host CRISPR region inhibits group behaviors of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 191 (1), 210-219 (2009).
- Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa. PloS One. 6 (6), 20888 (2011).
- Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple Environmental Factors Influence the Importance of the Phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa Swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), (2018).
- Boyle, K. E., Monaco, H., van Ditmarsch, D., Deforet, M., Xavier, J. B. Integration of Metabolic and Quorum Sensing Signals Governing the Decision to Cooperate in a Bacterial Social Trait. PLoS computational biology. 11 (5), 10004279 (2015).
- Bernier, S. P., Ha, D. -. G., Khan, W., Merritt, J. H., O’Toole, G. A. Modulation of Pseudomonas aeruginosa surface-associated group behaviors by individual amino acids through c-di-GMP signaling. Research in Microbiology. 162 (7), 680-688 (2011).
