Vi beskriver ett protokoll för att bedöma hjärtmorfologi och funktion hos vuxna zebrafiskar med högfrekvent ekokardiografi. Metoden möjliggör visualisering av hjärtat och efterföljande kvantifiering av funktionella parametrar, såsom puls (HR), hjärtutgång (CO), fraktionerad områdeförändring (FAC), utmatningsfraktion (EF) och blodflödeoch utflödeshastigheter.
Zebrafisken (Danio rerio) har blivit en mycket populär modellorganism inom kardiovaskulär forskning, inklusive mänskliga hjärtsjukdomar, till stor del på grund av dess embryonala öppenhet, genetiska tractability och bekvämligheter till snabba, höggenomströmningsstudier. Förlusten av öppenhet begränsar dock hjärtfunktionsanalysen i vuxenstadiet, vilket komplicerar modelleringen av åldersrelaterade hjärtproblem. För att övervinna sådana begränsningar, högfrekvent ultraljud ekokardiografi i zebrafisk växer fram som ett hållbart alternativ. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att bedöma hjärtfunktionen hos vuxna zebrafiskar med icke-invasiv ekokardiografi med högfrekvent ultraljud. Metoden möjliggör visualisering och analys av zebrafisk hjärta dimension och kvantifiering av viktiga funktionella parametrar, inklusive puls, stroke volym, hjärtminut, och utmatning fraktion. I denna metod snarasseder och hålls under vattnet och kan återvinnas efter ingreppet. Även om högfrekvent ultraljud är en dyr teknik, kan samma bildplattform användas för olika arter (t.ex. murine och zebrafisk) genom att anpassa olika givare. Zebrafisk ekokardiografi är en robust metod för hjärt fenotypning, användbar i validering och karakterisering av sjukdomsmodeller, särskilt sena sjukdomar; drogskärmar; studier av hjärtskada, återhämtning och regenerativ kapacitet.
Zebrafisken (Danio rerio) är en väletablerad ryggradsdjursmodell för studier av utvecklingsprocesser och mänskliga sjukdomar1. Zebrafisk har hög genetisk likhet med människor (70%), genetisk tractabilitet, hög fruktbarhet och optisk transparens under embryonal utveckling, vilket möjliggör direkt visuell analys av organ och vävnader, inklusive hjärtat. Trots att zebrafiskhjärtat (figur 1)bara har ett atrium och en kammare, är det fysiologiskt liknar däggdjursfyra kaminerade hjärtan. Viktigt, zebrafisk puls, elektrokardiogram morfologi, och åtgärder potential form liknar människors mer än murine arter2. Dessa funktioner har gjort zebrafisk en utmärkt modell för kardiovaskulär forskning och har gett stora insikter i hjärtutveckling3,4,förnyelse5, och patologiskt villkor31,,3,4, inklusive åderförkalkning, kardiomyopatier, arytmier, medfödda hjärtsjukdomar, och amyloid ljuskedja kardiotoxicitet1,4,,6. Bedömning av hjärtfunktionen har varit möjlig under det embryonala stadiet (1 dagar efter befruktning) genom direkt videoanalys med hjälp av höghastighetsvideomikroskopi7,8. Zebrafisk förlorar dock sin transparens bortom det embryonala stadiet, vilket begränsar funktionella utvärderingar av normala mogna hjärtan och sent debuten hjärtproblem. För att övervinna denna begränsning, ekokardiografi har framgångsrikt använts som en högupplöst, realtid, noninvasive imaging alternativ för att utvärdera vuxna zebrafisk hjärtfunktion9,10,,11,12,13,14,15.
I zebrafiskar ligger hjärtat ventrally i brösthålan omedelbart i bakre hand till gälarna med atriumet som ligger ryggmot ventrikeln. Atriumet samlar venöst blod från sinus venosus och överför det till ventrikeln där det pumpas vidare till bulbus arteriosus (figur 1). Här beskriver vi ett fysiologiskt, under vattnet, protokoll för att bedöma hjärtfunktionen hos vuxna zebrafiskar med icke-invasiv ekokardiografi med hjälp av en linjär matrisultraljudssond med en mittfrekvens på 50 MHz för B-lägesavbildning med en upplösning på 30 μm. Eftersom ultraljudsvågor lätt kan färdas genom vatten, hålla nära närheten mellan fisken och skanningssonden under vattnet ger tillräckligt med kontaktyta för hjärtdetektering utan behov av ultraljud gel och är totalt sett mindre stressande för fisken. Även alternativa zebrafisk ekokardiografi system rapporterades av flera författare9,12,13, här presenterar vi den allmänna och vanligaste installationen som gäller för högfrekventultraljud hos djur.
Metoden möjliggör högupplöst avbildning av det vuxna zebrafiskhjärtat, spårning av hjärtstrukturer och kvantifiering av topphastigheter från Dopplerblodflödesmätningar. Vi visar tillförlitlig in vivo kvantifiering av viktiga systoliska och diastoliska parametrar, såsom utmatningfraktion (EF), fraktionerad områdesförändring (FAC), ventrikulärt blodflöde och utflödeshastigheter, hjärtfrekvens (HR) och hjärtminutvolym (CO). Vi bidrar till att etablera ett tillförlitligt utbud av normala friska vuxna zebrafiskar hjärt funktionella och dimensionella parametrar för att möjliggöra en mer exakt utvärdering av patologiskt tillstånd. Sammantaget ger vi en robust metod för att bedöma hjärtfunktionen hos zebrafisk, som har visat sig vara mycket användbar för att etablera och validera zebrafisk hjärtsjukdommodeller66,16,hjärtskada och återhämtning10,,13,och förnyelse11,,12,och kan användas ytterligare för att utvärdera potentiella läkemedel.
Vi beskriver en systematisk metod för ekokardiografisk avbildning och bedömning av hjärtfunktion hos vuxna zebrafiskar. Ekokardiografi är den enda tillgängliga icke-invasiva och mest robusta metoden för levande vuxna fisk hjärt avbildning och funktionell analys, och det blir allt populärare i zebrafisk kardiovaskulär forskning. Den tid som behövs är kort och möjliggör höggenomströmning och longitudinella studier. Det finns dock stora skillnader i den metod som används och dataanalys. Standardisering av ze…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Fred Roberts tekniska stöd och revidering av manuskriptet.
Double sided tape | |||
Fish net | |||
Glass container – 100 inch high | |||
High frequency transducer | Fujifilm/VisualSonics | MX700 | Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm |
Plastic teaspoon | |||
Scalpel or scissors | |||
Small fish tanks | |||
Sponge (kitchen sponge) | |||
Transfer pipets (graduated 3 mL) | Samco Scientific | 212 | |
Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
Vevo 3100 Imaging system and imaging station | Fujifilm/VisualSonics | ||
Vevo LAB sofware v 1.7.1 | Fujifilm/VisualSonics |