高频超声超声心动图评估斑马鱼心脏功能

Summary

我们描述了一种使用高频回声心动图评估成年斑马鱼心脏形态和功能的协议。该方法允许心脏可视化和随后定量功能参数，如心率 （HR）、心脏输出 （CO）、小数面积变化 （FAC）、弹出分数 （EF） 以及血液流入和流出速度。

Abstract

斑马鱼（Danio rerio）已成为心血管研究中非常受欢迎的模型有机体，包括人类心脏病，这主要是因为它的胚胎透明度、遗传性和快速、高通量研究的便利性。然而，透明度的丧失限制了成人阶段的心脏功能分析，这使得与年龄相关的心脏病的建模复杂化。为了克服这些限制，斑马鱼的高频超声超声心动图正在成为一个可行的选择。在这里，我们提出了一个详细的协议，通过非侵入性超声心动图，使用高频超声来评估成年斑马鱼的心脏功能。该方法允许对斑马鱼的心脏尺寸进行可视化和分析，并量化重要的功能参数，包括心率、中风体积、心脏输出和弹出分数。在这种方法中，鱼被麻醉并保存在水下，手术后可以回收。虽然高频超声是一种昂贵的技术，但相同的成像平台可以通过调整不同的传感器来用于不同的物种（例如，鼠类和斑马鱼）。斑马鱼回声心动图是心脏排便的有力方法，可用于疾病模型，特别是晚期疾病的验证和表征;毒品屏幕;和心脏损伤，恢复和再生能力的研究。

Introduction

斑马鱼（Danio rerio）是研究发育过程和人类疾病的成熟脊椎动物^模型1。斑马鱼在胚胎发育过程中具有与人类（70%）的遗传相似性（70%）、遗传可感染性、高繁殖性和光学透明度，允许对器官和组织（包括心脏）进行直接视觉分析。尽管只有一个中庭和一个心室，斑马鱼的心脏（图1）在生理上类似于哺乳动物的四室心脏。重要的是，斑马鱼的心率、心电图形态和动作潜能形状比人类比鼠种更像^2。这些特点使斑马鱼成为心血管研究的优秀模型，为心脏发育^33、4、4再生⁵和病理状况^{11、3、43,4}提供了重要见解，包括动脉硬化、心肌病、心律失常、先天性心脏病和淀粉样蛋白光链心肌毒性^{1,1、4、6。,6}通过高速视频显微镜^77、88的直接视频分析，在胚胎阶段（受精后1天）可以评估心脏功能。然而，斑马鱼在胚胎阶段后失去透明度，限制了正常成熟心脏和晚发心脏状况的功能评估。为了克服这一限制，Echocardiix被成功地用作高分辨率、实时、非侵入性成像的替代品，以评估成年斑马鱼的心脏功能^9,109、10、11、12、13、14、15。^{,11,12,13,14,15}

在斑马鱼中，心脏位于胸腔中，紧接在刺的后部，中庭位于心室的背对背。中庭从窦静脉吸血中收集静脉血，并将其转移到心室，在那里进一步泵送至球状动脉（图1）。在这里，我们描述了一种生理、水下、协议，通过非侵入性超声心动图评估成年斑马鱼的心脏功能，使用中心频率为50 MHz的线性阵列超声探头，以30μm的分辨率进行B模式成像。由于超声波很容易在水中传播，因此在鱼和水下扫描探头之间保持接近，为心脏检测提供足够的接触面，无需超声波凝胶，而且对鱼的总体压力较小。虽然一^{些作者9、12、1312,13}报告了替代斑马鱼超声心动系统，但在这里我们介绍了适用于动物高频超声的通用和最常用的设置。

该方法允许对成年斑马鱼心脏进行高分辨率成像，追踪心脏结构，并从多普勒血流测量中量化峰值速度。我们在体内显示重要的收缩和舒张参数的可靠定量，如弹出分数 （EF）、小数区域变化 （FAC）、心室血液流入和流出速度、心率 （HR） 和心脏输出 （CO）。我们帮助建立一个可靠的正常健康成年斑马鱼心脏功能和尺寸参数的范围，以便更精确地评估病理状态。总体而言，我们为评估斑马鱼的心脏功能提供了一种可靠的方法，在建立和验证斑马鱼心脏病模型^66、16、16心脏损伤和恢复^10、13,13和再生^11、12,12中非常有用，并可用于进一步评估潜在的药物。

Protocol

涉及斑马鱼的所有程序均得到我们的机构动物护理和使用委员会的批准，并符合美国农业部动物福利法。 1. 实验设置 设置图像采集平台 使用小剪刀或手术刀在12点钟位置的海绵上切开，在扫描过程中握住鱼。将海绵放入玻璃容器中（图2A）。注：切口的位置应留出足够的空间来移动传感器，并在平台倾斜进行…

Representative Results

所述协议允许测量重要的心电图和功能参数，类似于人类和动物回声心动图中使用的技术。B-Mode 图像允许跟踪心室内壁（图 5），并获取尺寸数据（如室和壁尺寸）和功能数据（如心率、冲程体积和心脏输出）以及心室收缩函数的参数，如小数面积变化和弹出分数（表 1）。使用彩色多普勒模式图像在心室瓣的测量也提供心室流入和流出…

Discussion

描述了一种系统的方法，用于对成年斑马鱼进行心电成像和心脏功能评估。回声心动图是活成年鱼心脏成像和功能分析中唯一可用的非侵入性和最可靠的方法，在斑马鱼心血管研究中越来越受欢迎。所需时间很短，允许进行高通量和纵向研究。然而，所使用的方法和数据分析存在相当大的差异。当如此多的变量会影响即将到来的参数时，斑马鱼回声心动图的标准化是非常困难的。在进行实验研究?…

Materials

Double sided tape
Fish net
Glass container – 100 inch high
High frequency transducer	Fujifilm/VisualSonics	MX700	Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm
Plastic teaspoon
Scalpel or scissors
Small fish tanks
Sponge (kitchen sponge)
Transfer pipets (graduated 3 mL)	Samco Scientific	212
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich	A5040
Vevo 3100 Imaging system and imaging station	Fujifilm/VisualSonics
Vevo LAB sofware v 1.7.1	Fujifilm/VisualSonics