Ecocardiografia de ultrassom de alta frequência para avaliar a função cardíaca de zebrafish
Summary
Descrevemos um protocolo para avaliar a morfologia cardíaca e a função em zebrafish adultos usando ecocardiografia de alta frequência. O método permite a visualização do coração e posterior quantificação de parâmetros funcionais, como freqüência cardíaca (HR), saída cardíaca (CO), mudança de área fracionada (FAC), fração de ejeção (EF), e velocidades de fluxo e fluxo sanguíneo.
Abstract
O zebrafish (Danio rerio) tornou-se um organismo modelo muito popular em pesquisas cardiovasculares, incluindo doenças cardíacas humanas, em grande parte devido à sua transparência embrionária, trabilidade genética e amenidade a estudos rápidos e de alto nível. No entanto, a perda de transparência limita a análise da função cardíaca na fase adulta, o que complica a modelagem das condições cardíacas relacionadas à idade. Para superar tais limitações, a ecocardiografia de ultrassom de alta frequência em zebrafish está emergindo como uma opção viável. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para avaliar a função cardíaca em zebrafish adultos por ecocardiografia não invasiva usando ultrassom de alta frequência. O método permite a visualização e análise da dimensão cardíaca do zebrafish e a quantificação de parâmetros funcionais importantes, incluindo freqüência cardíaca, volume de derrame, saída cardíaca e fração de ejeção. Neste método, os peixes são anestesiados e mantidos debaixo d’água e podem ser recuperados após o procedimento. Embora o ultrassom de alta frequência seja uma tecnologia cara, a mesma plataforma de imagem pode ser usada para diferentes espécies (por exemplo, murina e zebrafish) adaptando diferentes transdutores. A ecocardiografia do zebrafish é um método robusto para fenotipagem cardíaca, útil na validação e caracterização de modelos de doenças, particularmente doenças de início tardio; telas de drogas; e estudos de lesão cardíaca, recuperação e capacidade regenerativa.
Introduction
O zebrafish (Danio rerio) é um modelo de vertebrados bem estabelecido para estudos de processos de desenvolvimento e doenças humanas1. Os zebrafish têm alta similaridade genética aos seres humanos (70%), trabilidade genética, alta fecundidade e transparência óptica durante o desenvolvimento embrionário, o que permite a análise visual direta de órgãos e tecidos, incluindo o coração. Apesar de ter apenas um átrio e um ventrículo, o coração de zebrafish (Figura 1) é fisiologicamente semelhante aos corações de quatro câmaras dos mamíferos. É importante ressaltar que a freqüência cardíaca do zebrafish, a morfologia eletrocardiograma e a forma potencial de ação se assemelham às dos seres humanos mais do que as espécies de murina2. Essas características tornaram o zebrafish um excelente modelo para a pesquisa cardiovascular e forneceram grandes insights sobre o desenvolvimento cardíaco3,4, regeneração5, e condições patológicas1,3,4, incluindo arteriosclerose, cardiomiopatias, arritmias, doenças cardíacas congênitas e cardiotoxicidade da cadeia de luz amilóide1,4,6. A avaliação da função cardíaca tem sido possível durante o estágio embrionário (1 dias após a fertilização) por meio da análise direta de vídeo utilizando microscopia de vídeo de alta velocidade7,8. No entanto, os zebrafish perdem sua transparência além do estágio embrionário, limitando avaliações funcionais de corações maduros normais e condições cardíacas de início tardio. Para superar essa limitação, a ecocardiografia tem sido empregada com sucesso como uma alternativa de imagem não invasiva de alta resolução, em tempo real e não invasiva para avaliar a função cardíaca do zebrafish adulto9,,10,,11,,12,,13,14,15.
Em zebrafish, o coração está localizado ventralmente na cavidade torácica imediatamente posterior às brânquias com o átrio localizado dorsal ao ventrículo. O átrio coleta sangue venoso do venoso sinusal e transfere-o para o ventrículo onde é ainda mais bombeado para o bulbo arterioso(Figura 1). Aqui, descrevemos um protocolo fisiológico, subaquático, para avaliar a função cardíaca em zebrafish adultos por ecocardiografia não invasiva usando uma sonda de ultrassom de matriz linear com uma freqüência central de 50 MHz para imagem de modo B em uma resolução de 30 μm. Uma vez que as ondas de ultrassom podem facilmente viajar através da água, manter a proximidade entre o peixe e a sonda de varredura debaixo d’água fornece superfície de contato suficiente para detecção cardíaca sem necessidade de gel de ultrassom e é no geral menos estressante para o peixe. Embora sistemas alternativos de ecocardiografia de zebrafish tenham sido relatados por vários autores9,12,13, aqui apresentamos a configuração geral e mais comumente utilizada que se aplica ao ultrassom de alta frequência em animais.
O método permite imagens de alta resolução do coração de zebrafish adulto, rastreamento de estruturas cardíacas e quantificação de velocidades de pico das medidas de fluxo sanguíneo Doppler. Mostramos quantificação in vivo confiável de parâmetros sistólicos e diastólicos importantes, como fração de ejeção (EF), mudança de área fracionada (FAC), fluxo de sangue ventricular e velocidades de saída, freqüência cardíaca (HR) e saída cardíaca (CO). Contribuímos para estabelecer uma gama confiável de parâmetros funcionais e dimensionais cardíacos adultos saudáveis e saudáveis para permitir uma avaliação mais precisa dos estados patológicos. No geral, fornecemos um método robusto para avaliar a função cardíaca em zebrafish, que tem se mostrado extremamente útil no estabelecimento e validação de doenças cardíacas zebrafishmodelos 6,16, lesão cardíaca e recuperação10,13, e regeneração11,12, e pode ser usado ainda para avaliar drogas potenciais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descrevemos um método sistemático para a imagem ecocardiográfica e avaliação da função cardíaca em zebrafish adultos. A ecocardiografia é o único método não invasivo e mais robusto disponível para imagem cardíaca de peixe adulto vivo e análise funcional, e está se tornando cada vez mais popular na pesquisa cardiovascular de zebrafish. O tempo necessário é curto e permite estudos longitudinais de alta duração e de alta duração. No entanto, há uma variação considerável na metodologia empregada e n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos o apoio técnico de Fred Roberts e a revisão do manuscrito.
Materials
| Double sided tape | |||
| Fish net | |||
| Glass container – 100 inch high | |||
| High frequency transducer | Fujifilm/VisualSonics | MX700 | Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm |
| Plastic teaspoon | |||
| Scalpel or scissors | |||
| Small fish tanks | |||
| Sponge (kitchen sponge) | |||
| Transfer pipets (graduated 3 mL) | Samco Scientific | 212 | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vevo 3100 Imaging system and imaging station | Fujifilm/VisualSonics | ||
| Vevo LAB sofware v 1.7.1 | Fujifilm/VisualSonics |
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