Hochfrequenz-Ultraschall-Echokardiographie zur Beurteilung der Herzfunktion von Zebrafischen
Summary
Wir beschreiben ein Protokoll zur Beurteilung der Herzmorphologie und -funktion bei erwachsenen Zebrafischen mittels hochfrequenter Echokardiographie. Die Methode ermöglicht die Visualisierung des Herzens und die anschließende Quantifizierung von funktionellen Parametern wie Herzfrequenz (HR), Herzleistung (CO), Bruchflächenänderung (FAC), Auswurffraktion (EF) sowie Blutzufluss- und Abflussgeschwindigkeiten.
Abstract
Der Zebrafisch (Danio rerio) hat sich zu einem sehr beliebten Modellorganismus in der kardiovaskulären Forschung, einschließlich menschlicher Herzkrankheiten, vor allem aufgrund seiner embryonalen Transparenz, genetischen Traktionsfähigkeit und Annehmlichkeiten für schnelle, Hochdurchsatzstudien. Der Verlust der Transparenz schränkt jedoch die Herzfunktionsanalyse im Erwachsenenstadium ein, was die Modellierung altersbedingter Herzerkrankungen erschwert. Um solche Einschränkungen zu überwinden, entwickelt sich die hochfrequente Ultraschall-Echokardiographie bei Zebrafischen als praktikable Option. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Beurteilung der Herzfunktion bei erwachsenen Zebrafischen durch nichtinvasive Echokardiographie mittels Hochfrequenz-Ultraschall vor. Die Methode ermöglicht die Visualisierung und Analyse der Zebrafischherzdimension und Quantifizierung wichtiger funktioneller Parameter, einschließlich Herzfrequenz, Schlaganfallvolumen, Herzleistung und Auswurffraktion. Bei dieser Methode werden die Fische beästhebt und unter Wasser gehalten und können nach dem Eingriff geborgen werden. Obwohl Hochfrequenz-Ultraschall eine teure Technologie ist, kann die gleiche Bildgebungsplattform für verschiedene Arten (z. B. Murin und Zebrafisch) verwendet werden, indem verschiedene Messumformer angepasst werden. Zebrafish-Echokardiographie ist eine robuste Methode zur kardialen Phänotypisierung, die bei der Validierung und Charakterisierung von Krankheitsmodellen, insbesondere spät auftretenden Krankheiten, nützlich ist; Drogen-Bildschirme; und Studien über Herzverletzungen, Genesung und Regenerationsfähigkeit.
Introduction
Der Zebrafisch (Danio rerio) ist ein etabliertes Wirbeltiermodell für Studien von Entwicklungsprozessen und menschlichen Krankheiten1. Zebrafische haben eine hohe genetische Ähnlichkeit mit Menschen (70%), genetische Traktionsfähigkeit, hohe Fruchtbarkeit und optische Transparenz während der embryonalen Entwicklung, die eine direkte visuelle Analyse von Organen und Geweben, einschließlich des Herzens, ermöglicht. Obwohl das Zebrafischherz nur über ein Atrium und einen Ventrikel verfügt (Abbildung 1), ist es physiologisch ähnlich wie Säugetier-Vierkammerherzen. Wichtig ist, dass die Herzfrequenz des Zebrafisches, die Elektrokardiogrammmorphologie und die Wirkungspotentialform denen des Menschen mehr ähneln als die murinen Arten2. Diese Eigenschaften haben Zebrafische zu einem ausgezeichneten Modell für die Kardiovaskuläre Forschung gemacht und haben wichtige Einblicke in die Herzentwicklung3,4, Regeneration5und pathologische Bedingungen1,3,4, einschließlich Arteriosklerose, Kardiomyopathien, Arrhythmien, angeborene Herzkrankheiten, und Amyloid Lichtkettenkardiotoxizität1,4,6. Die Beurteilung der Herzfunktion war während des embryonalen Stadiums (1 Tage nach der Befruchtung) durch direkte Videoanalyse mittels Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie7,8möglich. Zebrafische verlieren jedoch ihre Transparenz über das embryonale Stadium hinaus und begrenzen die funktionelle Bewertung normaler reifer Herzen und spät einsetzten Herzerkrankungen. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurde die Echokardiographie erfolgreich als hochauflösende, echtzeitfreie, nichtinvasive bildgebende Alternative zur Bewertung der Erwachsenen-Zebrafisch-Herzfunktion9,10,11,12,13,14,15eingesetzt.
Bei Zebrafischen befindet sich das Herz ventral in der Brusthöhle unmittelbar nach dem Ende der Kiemen mit dem Atrium dorsal zum Ventrikel. Das Atrium sammelt venöses Blut aus dem Sinus venosus und überträgt es in den Ventrikel, wo es weiter zum bulbus arteriosus gepumpt wird (Abbildung 1). Hier beschreiben wir ein physiologisches, Unterwasserprotokoll zur Beurteilung der Herzfunktion bei erwachsenen Zebrafischen durch nicht-invasive Echokardiographie mit einer linearen Array-Ultraschallsonde mit einer Mittelfrequenz von 50 MHz für die B-Modus-Bildgebung mit einer Auflösung von 30 m. Da Ultraschallwellen leicht durch Wasser wandern können, bietet die Nähe zwischen den Fischen und der Scansonde unter Wasser genügend Kontaktfläche für die Herzerkennung ohne Ultraschallgel und ist insgesamt weniger belastend für die Fische. Obwohl alternative Zebrafisch-Echokardiographie-Systeme von mehreren Autoren9,12,13berichtet wurden, stellen wir hier die allgemeine und am häufigsten verwendete Einrichtung vor, die für Hochfrequenz-Ultraschall bei Tieren gilt.
Die Methode ermöglicht eine hochauflösende Bildgebung des erwachsenen Zebrafischherzes, die Rückverfolgung von Herzstrukturen und die Quantifizierung von Spitzengeschwindigkeiten aus Doppler-Blutflussmessungen. Wir zeigen eine zuverlässige In-vivo-Quantifizierung wichtiger systolischer und diastolischer Parameter wie Auswurffraktion (EF), Bruchflächenänderung (FAC), ventrikuläre Blutzufluss- und Abflussgeschwindigkeiten, Herzfrequenz (HR) und Herzleistung (CO). Wir tragen dazu bei, ein zuverlässiges Sortiment an normalen gesunden erwachsenen Zebrafischen kardialen funktionellen und dimensionalen Parametern zu etablieren, um eine genauere Bewertung der pathologischen Zustände zu ermöglichen. Insgesamt bieten wir eine robuste Methode zur Beurteilung der Herzfunktion bei Zebrafischen, die sich bei der Etablierung und Validierung von Zebrafisch-Herzkrankheitsmodellen6,16, Herzverletzungen und Genesung10,13und Regeneration11,12als äußerst nützlich erwiesen hat und weiter zur Bewertung potenzieller Medikamente eingesetzt werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir beschreiben eine systematische Methode zur echokardiographischen Bildgebung und Beurteilung der Herzfunktion bei erwachsenen Zebrafischen. Echokardiographie ist die einzige verfügbare nicht-invasive und robusteste Methode für lebende erwachsene Fische Kardialbildgebung und funktionelle Analyse, und es wird immer beliebter in Zebrafisch Herz-Kreislauf-Forschung. Der benötigte Zeitaufwand ist kurz und ermöglicht Hochdurchsatz- und Längsuntersuchungen. Die angewandte Methodik und die Datenanalyse sind jedoch sehr u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Fred Roberts’ technischer Unterstützung und Überarbeitung des Manuskripts.
Materials
| Double sided tape | |||
| Fish net | |||
| Glass container – 100 inch high | |||
| High frequency transducer | Fujifilm/VisualSonics | MX700 | Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm |
| Plastic teaspoon | |||
| Scalpel or scissors | |||
| Small fish tanks | |||
| Sponge (kitchen sponge) | |||
| Transfer pipets (graduated 3 mL) | Samco Scientific | 212 | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vevo 3100 Imaging system and imaging station | Fujifilm/VisualSonics | ||
| Vevo LAB sofware v 1.7.1 | Fujifilm/VisualSonics |
References
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Verkerk, A. O., Remme, C. A. Zebrafish: a novel research tool for cardiac (patho)electrophysiology and ion channel disorders. Frontiers in Physiology. 3, 255 (2012).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular research. 91 (2), 279-288 (2011).
- Poon, K. L., Brand, T. The zebrafish model system in cardiovascular research: A tiny fish with mighty prospects. Global Cardiology Science and Practise. 2013 (1), 9-28 (2013).
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Mishra, S., et al. Zebrafish model of amyloid light chain cardiotoxicity: regeneration versus degeneration. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 316 (5), H1158-H1166 (2019).
- Shin, J. T., Pomerantsev, E. V., Mably, J. D., MacRae, C. A. High-resolution cardiovascular function confirms functional orthology of myocardial contractility pathways in zebrafish. Physiologycal Genomics. 42 (2), 300-309 (2010).
- Mishra, S., et al. Human amyloidogenic light chain proteins result in cardiac dysfunction, cell death, and early mortality in zebrafish. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 305 (1), H95-H103 (2013).
- Ernens, I., Lumley, A. I., Devaux, Y., Wagner, D. R. Use of Coronary Ultrasound Imaging to Evaluate Ventricular Function in Adult Zebrafish. Zebrafish. 13 (6), 477-480 (2016).
- González-Rosa, J. M., et al. Use of Echocardiography Reveals Reestablishment of Ventricular Pumping Efficiency and Partial Ventricular Wall Motion Recovery upon Ventricular Cryoinjury in the Zebrafish. PLoS One. 9 (12), (2014).
- Huang, C. C., Su, T. H., Shih, C. C. High-resolution tissue Doppler imaging of the zebrafish heart during its regeneration. Zebrafish. 12 (1), 48-57 (2015).
- Kang, B. J., et al. High-frequency dual mode pulsed wave Doppler imaging for monitoring the functional regeneration of adult zebrafish hearts. Journal of the Royal Society Interface. 12 (103), (2015).
- Lee, J., et al. Hemodynamics and ventricular function in a zebrafish model of injury and repair. Zebrafish. 11 (5), 447-454 (2014).
- Sun, L., Lien, C. L., Xu, X., Shung, K. K. In Vivo Cardiac Imaging of Adult Zebrafish Using High Frequency Ultrasound (45-75 MHz). Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (1), 31-39 (2008).
- Wang, L. W., Kesteven, S. H., Huttner, I. G., Feneley, M. P., Fatkin, D. High-Frequency Echocardiography- Transformative Clinical and Research Applications in Humans, Mice, and Zebrafish. Circulation Journal. 82 (3), 620-628 (2018).
- Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Disease Models & Mechanisms. 10 (1), 63 (2017).
- Lee, L., et al. Functional Assessment of Cardiac Responses of Adult Zebrafish (Danio rerio) to Acute and Chronic Temperature Change Using High-Resolution Echocardiography. PLOS ONE. 11 (1), e0145163 (2016).
- Genge, C. E., et al., Nilius, B., et al. . Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 171, 99-136 (2016).
