Højfrekvent ultralyd ekkokardiografi til vurdering zebrafisk hjertefunktion
Summary
Vi beskriver en protokol til vurdering af hjertemorfologi og funktion hos voksne zebrafisk ved hjælp af højfrekvent ekkokardiografi. Metoden gør det muligt at visualiseringe hjertet og efterfølgende kvantificering af funktionelle parametre, såsom puls (HR), hjerteoutput (CO), fraktioneret områdeændring (FAC), udslyngningsfraktion (EF) og blodindstrømnings- og udstrømningshastigheder.
Abstract
Zebrafisken (Danio rerio) er blevet en meget populær model organisme i hjerte-kar-forskning, herunder menneskelige hjertesygdomme, hovedsagelig på grund af sin embryonale gennemsigtighed, genetiske tractability, og faciliteter til hurtige, høj-throughput undersøgelser. Men tabet af gennemsigtighed begrænser hjertefunktionsanalyse på voksenstadiet, hvilket komplicerer modelleringen af aldersrelaterede hjertesygdomme. For at overvinde sådanne begrænsninger, højfrekvente ultralyd ekkokardiografi i zebrafisk er ved at opstå som en farbar vej. Her præsenterer vi en detaljeret protokol til vurdering af hjertefunktion hos voksne zebrafisk ved ikke-invasiv ekkokardiografi ved hjælp af højfrekvent ultralyd. Metoden giver mulighed for visualisering og analyse af zebrafisk hjertedimension og kvantificering af vigtige funktionelle parametre, herunder puls, slagtilfælde volumen, hjerte-output, og udslyngning fraktion. Ved denne metode, fiskene er bestøvet og holdes under vandet og kan inddrives efter proceduren. Selvom højfrekvent ultralyd er en dyr teknologi, kan den samme billeddannelsesplatform bruges til forskellige arter (f.eks. murine og zebrafisk) ved at tilpasse forskellige transducers. Zebrafisk ekkokardiografi er en robust metode til hjertefænotypebestemmelse, nyttig i validering og karakterisering af sygdomsmodeller, især sene debut sygdomme; narkotika skærme; undersøgelser af hjerteskade, restitution og regenerativ kapacitet.
Introduction
Zebrafisken (Danio rerio) er en veletableret hvirveldyrmodel for undersøgelser af udviklingsprocesser og sygdomme hos mennesker1. Zebrafisk har høj genetisk lighed med mennesker (70%), genetisk tractability, høj frugtbarhed, og optisk gennemsigtighed under embryonale udvikling, som giver mulighed for direkte visuel analyse af organer og væv, herunder hjertet. På trods af kun at have et atrium og en ventrikel, zebrafisk hjerte (Figur 1) er fysiologisk ligner pattedyr fire-chambered hjerter. Vigtigere er det, zebrafisk puls, elektrokardiogram morfologi, og handling potentielle form ligner dem af mennesker mere end murine arter2. Disse funktioner har gjort zebrafisk en fremragende model for hjerte-kar-forskning og har givet stor indsigt i hjerteudvikling3,4, regenerering5, og patologiske betingelser1,,3,,4, herunder åreforkalkning, kardiomyopatier, arytmier, medfødte hjertesygdomme, og amyloid lyskæde kardiotoksicitet1,4,6. Vurdering af hjertefunktion har været mulig i fosterstadiet (1 dage efter befrugtning) gennem direkte videoanalyse ved hjælp af højhastighedsvideomikroskopi7,8. Zebrafisk mister dog deres gennemsigtighed ud over fosterstadiet, hvilket begrænser funktionelle evalueringer af normale modne hjerter og sene hjertesygdomme. For at overvinde denne begrænsning er ekkokardiografi med succes blevet anvendt som et a-løsningsalternativ i realtid , noninvasive imaging til vurdering af voksne zebrafiskhjertefunktion9,10,11,12,13,14,15.
I zebrafisk, er hjertet placeret ventrally i brysthulen umiddelbart efter gællerne med atrium placeret dorsal til hjertetrikel. Atriet indsamler venøs blod fra sinus venosus og overfører det til hjertekammer, hvor det er yderligere pumpes til bulbus arteriosus (Figur 1). Her beskriver vi en fysiologisk, undersøisk protokol til vurdering af hjertefunktion hos voksne zebrafisk ved ikke-invasiv ekkokardiografi ved hjælp af en lineær array ultralydssonde med en centerfrekvens på 50 MHz for B-tilstandsbilleddannelse ved en opløsning på 30 μm. Da ultralydbølger nemt kan rejse gennem vand, giver det at holde nærhed mellem fisken og scanningsonden under vandet nok kontaktflade til hjertedetektering uden behov for ultralydsgel og er generelt mindre stressende for fisken. Selv om alternative zebrafisk ekkokardiografi systemer blev rapporteret af flere forfattere9,12,13, her præsenterer vi den generelle og mest almindeligt anvendte setup, der gælder for højfrekvente ultralyd hos dyr.
Metoden giver mulighed for høj opløsning billeddannelse af den voksne zebrafisk hjerte, sporing af hjertestrukturer, og kvantificering af peak-hastigheder fra Doppler blodgennemstrømning målinger. Vi viser pålidelig in vivo-kvantificering af vigtige systoliske og diastoliske parametre, såsom udslyngningsfraktion (EF), fraktioneret områdeændring (FAC), ventrikulær blodindstrømning og udstrømningshastigheder, puls (HR) og hjerteoutput (CO). Vi bidrager til at etablere et pålideligt udvalg af normale raske voksne zebrafisk hjertefunktionelle og dimensionelle parametre for at muliggøre en mere præcis evaluering af patologiske tilstande. Samlet set tilbyder vi en robust metode til at vurdere hjertefunktion hos zebrafisk, som har vist sig yderst nyttig til at etablere og validere zebrafisk hjertesygdom modeller6,16, hjerteskade og nyttiggørelse10,13, og regenerering11,12, og kan yderligere bruges til at vurdere potentielle lægemidler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver en systematisk metode til ekkokardiografisk billeddannelse og vurdering af hjertefunktion hos voksne zebrafisk. Ekkokardiografi er den eneste tilgængelige ikke-invasive og mest robuste metode til levende voksne fisk hjertebilleddannelse og funktionel analyse, og det bliver stadig mere populær i zebrafisk hjerte-kar-forskning. Den tid, der er behov for, er kort og giver mulighed for høj-throughput og langsgående undersøgelser. Der er imidlertid betydelige forskelle i den anvendte metode og dataanalysen. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Fred Roberts’ tekniske støtte og revision af manuskriptet.
Materials
| Double sided tape | |||
| Fish net | |||
| Glass container – 100 inch high | |||
| High frequency transducer | Fujifilm/VisualSonics | MX700 | Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm |
| Plastic teaspoon | |||
| Scalpel or scissors | |||
| Small fish tanks | |||
| Sponge (kitchen sponge) | |||
| Transfer pipets (graduated 3 mL) | Samco Scientific | 212 | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vevo 3100 Imaging system and imaging station | Fujifilm/VisualSonics | ||
| Vevo LAB sofware v 1.7.1 | Fujifilm/VisualSonics |
References
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Verkerk, A. O., Remme, C. A. Zebrafish: a novel research tool for cardiac (patho)electrophysiology and ion channel disorders. Frontiers in Physiology. 3, 255 (2012).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular research. 91 (2), 279-288 (2011).
- Poon, K. L., Brand, T. The zebrafish model system in cardiovascular research: A tiny fish with mighty prospects. Global Cardiology Science and Practise. 2013 (1), 9-28 (2013).
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Mishra, S., et al. Zebrafish model of amyloid light chain cardiotoxicity: regeneration versus degeneration. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 316 (5), H1158-H1166 (2019).
- Shin, J. T., Pomerantsev, E. V., Mably, J. D., MacRae, C. A. High-resolution cardiovascular function confirms functional orthology of myocardial contractility pathways in zebrafish. Physiologycal Genomics. 42 (2), 300-309 (2010).
- Mishra, S., et al. Human amyloidogenic light chain proteins result in cardiac dysfunction, cell death, and early mortality in zebrafish. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 305 (1), H95-H103 (2013).
- Ernens, I., Lumley, A. I., Devaux, Y., Wagner, D. R. Use of Coronary Ultrasound Imaging to Evaluate Ventricular Function in Adult Zebrafish. Zebrafish. 13 (6), 477-480 (2016).
- González-Rosa, J. M., et al. Use of Echocardiography Reveals Reestablishment of Ventricular Pumping Efficiency and Partial Ventricular Wall Motion Recovery upon Ventricular Cryoinjury in the Zebrafish. PLoS One. 9 (12), (2014).
- Huang, C. C., Su, T. H., Shih, C. C. High-resolution tissue Doppler imaging of the zebrafish heart during its regeneration. Zebrafish. 12 (1), 48-57 (2015).
- Kang, B. J., et al. High-frequency dual mode pulsed wave Doppler imaging for monitoring the functional regeneration of adult zebrafish hearts. Journal of the Royal Society Interface. 12 (103), (2015).
- Lee, J., et al. Hemodynamics and ventricular function in a zebrafish model of injury and repair. Zebrafish. 11 (5), 447-454 (2014).
- Sun, L., Lien, C. L., Xu, X., Shung, K. K. In Vivo Cardiac Imaging of Adult Zebrafish Using High Frequency Ultrasound (45-75 MHz). Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (1), 31-39 (2008).
- Wang, L. W., Kesteven, S. H., Huttner, I. G., Feneley, M. P., Fatkin, D. High-Frequency Echocardiography- Transformative Clinical and Research Applications in Humans, Mice, and Zebrafish. Circulation Journal. 82 (3), 620-628 (2018).
- Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Disease Models & Mechanisms. 10 (1), 63 (2017).
- Lee, L., et al. Functional Assessment of Cardiac Responses of Adult Zebrafish (Danio rerio) to Acute and Chronic Temperature Change Using High-Resolution Echocardiography. PLOS ONE. 11 (1), e0145163 (2016).
- Genge, C. E., et al., Nilius, B., et al. . Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 171, 99-136 (2016).
