Høyfrekvent ultralyd ekkokardiografi for å vurdere zebrafish hjertefunksjon
Summary
Vi beskriver en protokoll for å vurdere hjertemorfologi og funksjon i voksen sebrafisk ved hjelp av høyfrekvent ekkokardiografi. Metoden tillater visualisering av hjertet og påfølgende kvantifisering av funksjonelle parametere, for eksempel hjertefrekvens (HR), hjerteutgang (CO), fraksjonell områdeendring (FAC), utstøtingsfraksjon (EF) og blodstrøm og utstrømningshastigheter.
Abstract
Sebrafisken (Danio rerio) har blitt en svært populær modellorganisme i kardiovaskulær forskning, inkludert menneskelige hjertesykdommer, hovedsakelig på grunn av embryonisk gjennomsiktighet, genetisk tractability og fasilitet til raske, høygjennomstrømningsstudier. Tap av åpenhet begrenser imidlertid hjertefunksjonsanalyse på voksenstadiet, noe som kompliserer modellering av aldersrelaterte hjertesykdommer. For å overvinne slike begrensninger, er høyfrekvent ultralyd ekkokardiografi i sebrafisk fremsom et levedyktig alternativ. Her presenterer vi en detaljert protokoll for å vurdere hjertefunksjon hos voksen sebrafisk ved ikke-invasiv ekkokardiografi ved hjelp av høyfrekvent ultralyd. Metoden tillater visualisering og analyse av sebrafisk hjertedimensjon og kvantifisering av viktige funksjonelle parametere, inkludert hjertefrekvens, slagvolum, hjerteutgang og utstøtingsfraksjon. I denne metoden blir fisken bedøvet og holdt under vann og kan gjenopprettes etter prosedyren. Selv om høyfrekvent ultralyd er en dyr teknologi, kan den samme bildeplattformen brukes til forskjellige arter (f.eks. murine og sebrafisk) ved å tilpasse forskjellige transdusere. Sebrafisk ekkokardiografi er en robust metode for hjerte fenotyping, nyttig i validering og karakterisering av sykdomsmodeller, spesielt sen sykdommer; narkotika skjermer; studier av hjerteskade, restitusjon og regenerativ kapasitet.
Introduction
Sebrafisken (Danio rerio) er en veletablert virveldyrmodell for studier av utviklingsprosesser og menneskelige sykdommer1. Sebrafisk har høy genetisk likhet med mennesker (70%), genetisk tractability, høy fecundity, og optisk åpenhet under embryonisk utvikling, som tillater direkte visuell analyse av organer og vev, inkludert hjertet. Til tross for å ha bare ett atrium og ett ventrikkel, er sebrafiskhjertet (Figur 1) fysiologisk lik pattedyr fire-kammerhjerter. Viktigere, sebrafisk hjertefrekvens, elektrokardiogram morfologi, og virkning ser potensial form på mennesker mer enn murine arter2. Disse funksjonene har gjort sebrafisk til en utmerket modell for kardiovaskulær forskning5og har gitt stor innsikt i hjerteutvikling3,,4, regenerering 5 , og patologiske forhold1,3,4 ,inkludertarteriosklerose, kardiomyopatier, arytmier, medfødte hjertesykdommer, og amyloid lyskjede kardiotoksisitet1,4,6. Vurdering av hjertefunksjon har vært mulig i embryonale stadiet (1-dagers etter befruktning) gjennom direkte videoanalyse ved hjelp av høyhastighets videomikroskopi7,,8. Sebrafisk mister imidlertid sin åpenhet utover embryonale stadium, og begrenser funksjonelle evalueringer av normale modne hjerter og sene hjertesykdommer. For å overvinne denne begrensningen, har ekkokardiografi blitt vellykket ansatt som en høyoppløselig, sanntid, ikke-invasiv bildebehandling alternativ for å evaluere voksen sebrafisk hjertefunksjon9,10,11,12,13,14,15.
I sebrafisk ligger hjertet ventrally i thoraxhulen umiddelbart bakre til gjellene med atriumet som ligger dorsal til ventrikkelen. Atriet samler venøs blod fra sinusvenosus og overfører det til ventrikkelen hvor det pumpes videre til bulbus arteriosus (Figur 1). Her beskriver vi en fysiologisk, undervannsprotokoll for å vurdere hjertefunksjon hos voksen sebrafisk ved ikke-invasiv ekkokardiografi ved hjelp av en lineær array ultralydsonde med en senterfrekvens på 50 MHz for B-modusavbildning med en oppløsning på 30 μm. Siden ultralydbølger lett kan reise gjennom vann, holder nærhet mellom fisken og skannesonden under vann gir nok kontaktoverflate for hjertedeteksjon uten behov for ultralydgel og er generelt mindre stressende for fisken. Selv om alternative sebrafisk ekkokardiografisystemer ble rapportert av flere forfattere9,12,13, her presenterer vi det generelle og mest brukte oppsettet som gjelder for høyfrekvent ultralyd hos dyr.
Metoden tillater høyoppløselig avbildning av voksen sebrafisk hjerte, sporing av hjertestrukturer, og kvantifisering av peak-hastigheter fra Doppler blodstrøm målinger. Vi viser pålitelig in vivo kvantifisering av viktige systoliske og diastoliske parametere, for eksempel utstøtingsfraksjon (EF), fraksjonell områdeendring (FAC), ventrikulær blodstrøm og utstrømningshastigheter, hjertefrekvens (HR) og hjerteutgang (CO). Vi bidrar til å etablere et pålitelig utvalg av normale friske voksne sebrafisk hjertefunksjonelle og dimensjonale parametere for å tillate en mer presis evaluering av patologiske tilstander. Samlet sett gir vi en robust metode for å vurdere hjertefunksjon i sebrafisk, som har vist seg svært nyttig i å etablere og validere sebrafisk hjertesykdom modeller6,16, hjerteskade og utvinning10,13, og regenerering11,12, og kan videre brukes til å evaluere potensielle legemidler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver en systematisk metode for ekkokardiografisk avbildning og vurdering av hjertefunksjon hos voksen sebrafisk. Ekkokardiografi er den eneste tilgjengelige ikke-invasive og mest robuste metoden for levende voksen fisk hjerteavbildning og funksjonell analyse, og det blir stadig mer populært i sebrafisk kardiovaskulær forskning. Mengden av tid som trengs er kort og gir mulighet for høy gjennomstrømning og langsgående studier. Det er imidlertid stor variasjon i metodikken som er brukt og dataanalyse. Standardi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Fred Roberts’ tekniske støtte og revisjon av manuskriptet.
Materials
| Double sided tape | |||
| Fish net | |||
| Glass container – 100 inch high | |||
| High frequency transducer | Fujifilm/VisualSonics | MX700 | Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm |
| Plastic teaspoon | |||
| Scalpel or scissors | |||
| Small fish tanks | |||
| Sponge (kitchen sponge) | |||
| Transfer pipets (graduated 3 mL) | Samco Scientific | 212 | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vevo 3100 Imaging system and imaging station | Fujifilm/VisualSonics | ||
| Vevo LAB sofware v 1.7.1 | Fujifilm/VisualSonics |
References
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Verkerk, A. O., Remme, C. A. Zebrafish: a novel research tool for cardiac (patho)electrophysiology and ion channel disorders. Frontiers in Physiology. 3, 255 (2012).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular research. 91 (2), 279-288 (2011).
- Poon, K. L., Brand, T. The zebrafish model system in cardiovascular research: A tiny fish with mighty prospects. Global Cardiology Science and Practise. 2013 (1), 9-28 (2013).
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Mishra, S., et al. Zebrafish model of amyloid light chain cardiotoxicity: regeneration versus degeneration. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 316 (5), H1158-H1166 (2019).
- Shin, J. T., Pomerantsev, E. V., Mably, J. D., MacRae, C. A. High-resolution cardiovascular function confirms functional orthology of myocardial contractility pathways in zebrafish. Physiologycal Genomics. 42 (2), 300-309 (2010).
- Mishra, S., et al. Human amyloidogenic light chain proteins result in cardiac dysfunction, cell death, and early mortality in zebrafish. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 305 (1), H95-H103 (2013).
- Ernens, I., Lumley, A. I., Devaux, Y., Wagner, D. R. Use of Coronary Ultrasound Imaging to Evaluate Ventricular Function in Adult Zebrafish. Zebrafish. 13 (6), 477-480 (2016).
- González-Rosa, J. M., et al. Use of Echocardiography Reveals Reestablishment of Ventricular Pumping Efficiency and Partial Ventricular Wall Motion Recovery upon Ventricular Cryoinjury in the Zebrafish. PLoS One. 9 (12), (2014).
- Huang, C. C., Su, T. H., Shih, C. C. High-resolution tissue Doppler imaging of the zebrafish heart during its regeneration. Zebrafish. 12 (1), 48-57 (2015).
- Kang, B. J., et al. High-frequency dual mode pulsed wave Doppler imaging for monitoring the functional regeneration of adult zebrafish hearts. Journal of the Royal Society Interface. 12 (103), (2015).
- Lee, J., et al. Hemodynamics and ventricular function in a zebrafish model of injury and repair. Zebrafish. 11 (5), 447-454 (2014).
- Sun, L., Lien, C. L., Xu, X., Shung, K. K. In Vivo Cardiac Imaging of Adult Zebrafish Using High Frequency Ultrasound (45-75 MHz). Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (1), 31-39 (2008).
- Wang, L. W., Kesteven, S. H., Huttner, I. G., Feneley, M. P., Fatkin, D. High-Frequency Echocardiography- Transformative Clinical and Research Applications in Humans, Mice, and Zebrafish. Circulation Journal. 82 (3), 620-628 (2018).
- Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Disease Models & Mechanisms. 10 (1), 63 (2017).
- Lee, L., et al. Functional Assessment of Cardiac Responses of Adult Zebrafish (Danio rerio) to Acute and Chronic Temperature Change Using High-Resolution Echocardiography. PLOS ONE. 11 (1), e0145163 (2016).
- Genge, C. E., et al., Nilius, B., et al. . Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 171, 99-136 (2016).
