Högfrekvent ultraljud ekokardiografi för att bedöma zebrafisk hjärtfunktion
Summary
Vi beskriver ett protokoll för att bedöma hjärtmorfologi och funktion hos vuxna zebrafiskar med högfrekvent ekokardiografi. Metoden möjliggör visualisering av hjärtat och efterföljande kvantifiering av funktionella parametrar, såsom puls (HR), hjärtutgång (CO), fraktionerad områdeförändring (FAC), utmatningsfraktion (EF) och blodflödeoch utflödeshastigheter.
Abstract
Zebrafisken (Danio rerio) har blivit en mycket populär modellorganism inom kardiovaskulär forskning, inklusive mänskliga hjärtsjukdomar, till stor del på grund av dess embryonala öppenhet, genetiska tractability och bekvämligheter till snabba, höggenomströmningsstudier. Förlusten av öppenhet begränsar dock hjärtfunktionsanalysen i vuxenstadiet, vilket komplicerar modelleringen av åldersrelaterade hjärtproblem. För att övervinna sådana begränsningar, högfrekvent ultraljud ekokardiografi i zebrafisk växer fram som ett hållbart alternativ. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att bedöma hjärtfunktionen hos vuxna zebrafiskar med icke-invasiv ekokardiografi med högfrekvent ultraljud. Metoden möjliggör visualisering och analys av zebrafisk hjärta dimension och kvantifiering av viktiga funktionella parametrar, inklusive puls, stroke volym, hjärtminut, och utmatning fraktion. I denna metod snarasseder och hålls under vattnet och kan återvinnas efter ingreppet. Även om högfrekvent ultraljud är en dyr teknik, kan samma bildplattform användas för olika arter (t.ex. murine och zebrafisk) genom att anpassa olika givare. Zebrafisk ekokardiografi är en robust metod för hjärt fenotypning, användbar i validering och karakterisering av sjukdomsmodeller, särskilt sena sjukdomar; drogskärmar; studier av hjärtskada, återhämtning och regenerativ kapacitet.
Introduction
Zebrafisken (Danio rerio) är en väletablerad ryggradsdjursmodell för studier av utvecklingsprocesser och mänskliga sjukdomar1. Zebrafisk har hög genetisk likhet med människor (70%), genetisk tractabilitet, hög fruktbarhet och optisk transparens under embryonal utveckling, vilket möjliggör direkt visuell analys av organ och vävnader, inklusive hjärtat. Trots att zebrafiskhjärtat (figur 1)bara har ett atrium och en kammare, är det fysiologiskt liknar däggdjursfyra kaminerade hjärtan. Viktigt, zebrafisk puls, elektrokardiogram morfologi, och åtgärder potential form liknar människors mer än murine arter2. Dessa funktioner har gjort zebrafisk en utmärkt modell för kardiovaskulär forskning och har gett stora insikter i hjärtutveckling3,4,förnyelse5, och patologiskt villkor31,,3,4, inklusive åderförkalkning, kardiomyopatier, arytmier, medfödda hjärtsjukdomar, och amyloid ljuskedja kardiotoxicitet1,4,,6. Bedömning av hjärtfunktionen har varit möjlig under det embryonala stadiet (1 dagar efter befruktning) genom direkt videoanalys med hjälp av höghastighetsvideomikroskopi7,8. Zebrafisk förlorar dock sin transparens bortom det embryonala stadiet, vilket begränsar funktionella utvärderingar av normala mogna hjärtan och sent debuten hjärtproblem. För att övervinna denna begränsning, ekokardiografi har framgångsrikt använts som en högupplöst, realtid, noninvasive imaging alternativ för att utvärdera vuxna zebrafisk hjärtfunktion9,10,,11,12,13,14,15.
I zebrafiskar ligger hjärtat ventrally i brösthålan omedelbart i bakre hand till gälarna med atriumet som ligger ryggmot ventrikeln. Atriumet samlar venöst blod från sinus venosus och överför det till ventrikeln där det pumpas vidare till bulbus arteriosus (figur 1). Här beskriver vi ett fysiologiskt, under vattnet, protokoll för att bedöma hjärtfunktionen hos vuxna zebrafiskar med icke-invasiv ekokardiografi med hjälp av en linjär matrisultraljudssond med en mittfrekvens på 50 MHz för B-lägesavbildning med en upplösning på 30 μm. Eftersom ultraljudsvågor lätt kan färdas genom vatten, hålla nära närheten mellan fisken och skanningssonden under vattnet ger tillräckligt med kontaktyta för hjärtdetektering utan behov av ultraljud gel och är totalt sett mindre stressande för fisken. Även alternativa zebrafisk ekokardiografi system rapporterades av flera författare9,12,13, här presenterar vi den allmänna och vanligaste installationen som gäller för högfrekventultraljud hos djur.
Metoden möjliggör högupplöst avbildning av det vuxna zebrafiskhjärtat, spårning av hjärtstrukturer och kvantifiering av topphastigheter från Dopplerblodflödesmätningar. Vi visar tillförlitlig in vivo kvantifiering av viktiga systoliska och diastoliska parametrar, såsom utmatningfraktion (EF), fraktionerad områdesförändring (FAC), ventrikulärt blodflöde och utflödeshastigheter, hjärtfrekvens (HR) och hjärtminutvolym (CO). Vi bidrar till att etablera ett tillförlitligt utbud av normala friska vuxna zebrafiskar hjärt funktionella och dimensionella parametrar för att möjliggöra en mer exakt utvärdering av patologiskt tillstånd. Sammantaget ger vi en robust metod för att bedöma hjärtfunktionen hos zebrafisk, som har visat sig vara mycket användbar för att etablera och validera zebrafisk hjärtsjukdommodeller66,16,hjärtskada och återhämtning10,,13,och förnyelse11,,12,och kan användas ytterligare för att utvärdera potentiella läkemedel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver en systematisk metod för ekokardiografisk avbildning och bedömning av hjärtfunktion hos vuxna zebrafiskar. Ekokardiografi är den enda tillgängliga icke-invasiva och mest robusta metoden för levande vuxna fisk hjärt avbildning och funktionell analys, och det blir allt populärare i zebrafisk kardiovaskulär forskning. Den tid som behövs är kort och möjliggör höggenomströmning och longitudinella studier. Det finns dock stora skillnader i den metod som används och dataanalys. Standardisering av ze…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Fred Roberts tekniska stöd och revidering av manuskriptet.
Materials
| Double sided tape | |||
| Fish net | |||
| Glass container – 100 inch high | |||
| High frequency transducer | Fujifilm/VisualSonics | MX700 | Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm |
| Plastic teaspoon | |||
| Scalpel or scissors | |||
| Small fish tanks | |||
| Sponge (kitchen sponge) | |||
| Transfer pipets (graduated 3 mL) | Samco Scientific | 212 | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vevo 3100 Imaging system and imaging station | Fujifilm/VisualSonics | ||
| Vevo LAB sofware v 1.7.1 | Fujifilm/VisualSonics |
References
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Verkerk, A. O., Remme, C. A. Zebrafish: a novel research tool for cardiac (patho)electrophysiology and ion channel disorders. Frontiers in Physiology. 3, 255 (2012).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular research. 91 (2), 279-288 (2011).
- Poon, K. L., Brand, T. The zebrafish model system in cardiovascular research: A tiny fish with mighty prospects. Global Cardiology Science and Practise. 2013 (1), 9-28 (2013).
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Mishra, S., et al. Zebrafish model of amyloid light chain cardiotoxicity: regeneration versus degeneration. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 316 (5), H1158-H1166 (2019).
- Shin, J. T., Pomerantsev, E. V., Mably, J. D., MacRae, C. A. High-resolution cardiovascular function confirms functional orthology of myocardial contractility pathways in zebrafish. Physiologycal Genomics. 42 (2), 300-309 (2010).
- Mishra, S., et al. Human amyloidogenic light chain proteins result in cardiac dysfunction, cell death, and early mortality in zebrafish. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 305 (1), H95-H103 (2013).
- Ernens, I., Lumley, A. I., Devaux, Y., Wagner, D. R. Use of Coronary Ultrasound Imaging to Evaluate Ventricular Function in Adult Zebrafish. Zebrafish. 13 (6), 477-480 (2016).
- González-Rosa, J. M., et al. Use of Echocardiography Reveals Reestablishment of Ventricular Pumping Efficiency and Partial Ventricular Wall Motion Recovery upon Ventricular Cryoinjury in the Zebrafish. PLoS One. 9 (12), (2014).
- Huang, C. C., Su, T. H., Shih, C. C. High-resolution tissue Doppler imaging of the zebrafish heart during its regeneration. Zebrafish. 12 (1), 48-57 (2015).
- Kang, B. J., et al. High-frequency dual mode pulsed wave Doppler imaging for monitoring the functional regeneration of adult zebrafish hearts. Journal of the Royal Society Interface. 12 (103), (2015).
- Lee, J., et al. Hemodynamics and ventricular function in a zebrafish model of injury and repair. Zebrafish. 11 (5), 447-454 (2014).
- Sun, L., Lien, C. L., Xu, X., Shung, K. K. In Vivo Cardiac Imaging of Adult Zebrafish Using High Frequency Ultrasound (45-75 MHz). Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (1), 31-39 (2008).
- Wang, L. W., Kesteven, S. H., Huttner, I. G., Feneley, M. P., Fatkin, D. High-Frequency Echocardiography- Transformative Clinical and Research Applications in Humans, Mice, and Zebrafish. Circulation Journal. 82 (3), 620-628 (2018).
- Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Disease Models & Mechanisms. 10 (1), 63 (2017).
- Lee, L., et al. Functional Assessment of Cardiac Responses of Adult Zebrafish (Danio rerio) to Acute and Chronic Temperature Change Using High-Resolution Echocardiography. PLOS ONE. 11 (1), e0145163 (2016).
- Genge, C. E., et al., Nilius, B., et al. . Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 171, 99-136 (2016).
