JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biology

Målinger av fysiologiske stressresponser i C. Elegans

Published: May 21, 2020
doi:
10.3791/61001
, , , , , , ,
1Department of Molecular and Cell Biology,University of California, Berkeley

Summary

Her karakteriserer vi cellulære proteotoksiske stressresponser i nematoden C. elegans ved å måle aktiveringen av fluorescerende transkripsjonelle journalister og assaying følsomhet for fysiologisk stress.

Abstract

Organismer blir ofte utsatt for varierende miljøer og endringer i intracellulær homeostase, som kan ha skadelige effekter på deres proteome og fysiologi. Dermed har organismer utviklet seg målrettet og spesifikke stressresponser dedikert til å reparere skade og opprettholde homeostase. Disse mekanismene inkluderer den utfoldede proteinresponsen til endoplasmatisk reticulum (UPRER),den utfoldede proteinresponsen til mitokondriene (UPRMT),varmesjokkresponsen (HSR) og oksidativ stressrespons (OxSR). Protokollene som presenteres her beskriver metoder for å oppdage og karakterisere aktiveringen av disse banene og deres fysiologiske konsekvenser i nematoden, C. elegans. For det første er bruk av veispesifikke fluorescerende transkripsjonelle reportere beskrevet for rask cellulær karakterisering, narkotikascreening eller storskala genetisk screening (f.eks. RNAi eller mutantbiblioteker). I tillegg beskrives komplementære, robuste fysiologiske analyser, som kan brukes til å direkte vurdere følsomhet en dyr til spesifikke stressfaktorer, og fungerer som funksjonell validering av transkripsjonsreporterne. Sammen tillater disse metodene rask karakterisering av cellulære og fysiologiske effekter av interne og eksterne proteotoksiske perturbasjoner.

Introduction

Evnen til en organisme til å reagere på endringer i det intra- og ekstracellulære miljøet er avgjørende for sin overlevelse og tilpasning. Dette oppnås på cellenivå gjennom mange beskyttende veier som sikrer cellens integritet. Mens mange cellulære komponenter er utsatt for stress-assosiert skade, en stor involvering av cellulære stress responser er å reparere og beskytte homeostase av cellulær proteome. Men kompartaliseringen av proteiner i spesielle strukturer, kalt organeller, utgjør en utfordring for cellen, da den ikke kan stole på en sentralisert form for proteinkvalitetskontroll for å sikre at alle proteinene i cellen er riktig brettet og funksjonelle. Derfor, for å håndtere perturbasjoner til sine proteiner, har organeller utviklet dedikerte kvalitetskontrollmekanismer, noe som kan føle feilfoldede proteiner og aktivere en stressrespons i et forsøk på å lindre stresset i det rommet. For eksempel er cytosol avhengig av varmesjokkresponsen (HSR), mens endoplasmatisk reticulum (ER) og mitokondrier er avhengige av deres kupéspesifikke utfoldede proteinresponser (UPR). OxSR tjener til å lindre de toksiske effektene av reaktive oksygenarter (ROS). Hver stressrespons utløses i nærvær av cellulære utfordringer og miljøfornærmelser og induserer en skreddersydd transkripsjonsrespons. Kjennetegnene på disse svarene inkluderer syntetiserende molekyler som re-fold misfolded proteiner (som chaperones) rettet mot riktig organelle, eller alternativt fjerne skadede proteiner ved protein nedbrytning. Unnlatelse av å aktivere disse stressresponsene resulterer i akkumulering av skadede proteiner, cellulær dysfunksjon forplantet til systemisk svikt i vev, og til slutt død av organismen. Funksjonen og reguleringen av de ulike stresssvarene gjennomgås andre steder1.

Mange innsikter om regulering og aktivitet av cellulære stressresponser har blitt tilskrevet nematode, Caenorhabditis elegans, en flercellet modell organisme i genetisk forskning. Nematoder tillater ikke bare å studere aktivering av stressresponser på cellenivå, men også på organismenivå; nematoder har blitt brukt til å studere effekten av genetiske perturbasjoner eller eksponering for narkotika og forurensende stoffer på deres vekst og overlevelse. Deres raske generasjonstid, isogeni, åpenhet, genetisk tractability og brukervennlighet under eksperimentering gjør dem ideelle for slike studier. I tillegg gjør den relativt raske fysiologiske responsen på stress (mellom timer og noen dager) og evolusjonær bevaring av cellulære veier nematoder til et fremtredende verktøy for å studere stressresistens.

Det er to vanlige E. coli stammer som brukes som matkilde for å vokse C. elegans: standard OP50, en B-stamme der de fleste eksperimentering har blitt historisk utført2 og HT115, en K-12 stamme som brukes til nesten alle RNAi eksperimenter3,4. Det er viktig å merke seg at det er betydelige forskjeller mellom OP50 og HT115 bakterielle dietter. Vekst på disse forskjellige bakterielle kildene har vist seg å forårsake store forskjeller i metabolsk profil, mitokondrie DNA kopi nummer, og flere store fenotyper, inkludert levetid5. Noen av disse forskjellene tilskrives Vitamin B12 mangel forbundet med vekst på OP50 bakterier, noe som kan resultere i defekter i mitokondrie homeostase og økt følsomhet for patogener og påkjenninger. Alle disse fenotypene har vist seg å bli lindret av vekst på HT115 bakterier, som har høyere nivåer av vitamin B126. Derfor anbefales det at alle eksperimenter på fysiologiske stressresponser utføres på HT115-bakterier, uavhengig av nødvendigheten av RNAi-forhold. Men på grunn av den enkle å opprettholde dyr på OP50, kan all standard vekst (dvs. vedlikehold og forsterkning av dyr) utføres på OP50, da betydelige forskjeller i de eksperimentelle paradigmene som er beskrevet her ikke ble oppdaget i ormer opprettholdt på OP50 så lenge de ble flyttet til HT115 postsynkronisering (dvs. fra luke etter bleking med eller uten L1 arrestere) før eksperimentering.

Her er karakteriseringen av aktiviteten til cellulære stressresponser ved hjelp av to funksjonelle metoder beskrevet. Det bør bemerkes at protokollene som presenteres er primært fokusert på cellulære stressresponser og deres innvirkning på protein homeostase. For det første benyttes fluorescerende transkripsjonsreportere, som reguleres av endogene genarrangører som er spesielt aktivert som svar på ulike cellulære påkjenninger. Disse fluorescerende transkripsjonelle journalistene er basert på transkripsjonsinduksjon av spesifikke gener som er opprinnelig en del av stressresponsen. For eksempel aktiveres HSP-4, et varmesjokkprotein ortolog til den menneskelige chaperone HSPA5/BiP, på ER-stress og lokaliserer til ER for å lindre stresset. Under forhold med ER-stress (f.eks. eksponering for tunikamycin), et grønt fluorescerende protein (GFP), plassert under regulering av hsp-4-promotoren, syntetiseres i høye nivåer som kan vurderes ved fluorescerende mikroskopi eller kvantitativt målt ved hjelp av cytometri av nematoder7. På samme måte benyttes arrangøren av en mitokondriechaperone, hsp-6 (ortolog til pattedyr HSPA9), til å overvåke aktiveringen av UPRMT8, og arrangøren av den cytosolic chaperone hsp-16.2 (ortolog til de menneskelige krystallinske alfagenene) brukes til å vurdere aktiviteten til HSR9. Disse reporterne tillater en rask karakterisering av banene aktivert som svar på ulike perturbasjoner.

Ofte er journalistene som presenteres her avbildet ved hjelp av mikroskopi, noe som gir en kvalitativ effekt av aktiveringen av stressresponser. Men mens bildeteknikker gir både informasjon om intensitet og vevplassering av journalistene beskrevet ovenfor, er kvantifiseringen ikke alltid nøyaktig eller robust. Selv om det er mulig å kvantifisere fluorescerende aktivering ved hjelp av bildeanalyseverktøy, er disse metodene relativt lave gjennomstrømnings- og prøvestørrelsen liten, på grunn av det relativt lave antallet dyr avbildet. Den enkle og evne til å oppnå store mengder dyr raskt gjøre C. elegans et ideelt modellsystem for å si aktivering av fluorescerende stress reportere gjennom bruk av en stor partikkel flyt cytometer. En stor partikkelflyt cytometer er i stand til å registrere, analysere og sortere basert på størrelse og fluorescens fra mange levende dyr. Ved hjelp av denne metoden er det mulig å få fluorescerende intensitet, størrelse og også romlig (2D) informasjon for tusenvis av ormer. Systemet styres ved hjelp av FlowPilot, som gjør det mulig for sanntidsdatainnsamling og analyse av de målte parametrene. Her tilbys metoder for både mikroskopisk avbildning og kvantitativ analyse ved hjelp av et cytometer for storpartikkelflyt som metoder for å måle aktiveringen av stressresponser.

Utover reporteranalyse kan følsomheten eller motstanden til dyr mot stress måles ved hjelp av fysiologiske stressanalyser. Dette oppnås ved å utsette dyr for stressende miljøer som aktiverer spesifikke cellulære stressveier. Her er det gitt flere metoder for å måle følsomheten til hele dyr til bestemte typer stressfaktorer.

ER stress påføres C. elegans ved hjelp av kjemisk middel, tunikamycin, som blokkerer N-koblet glykosylering, forårsaker akkumulering av feilfoldede proteiner i ER10. I C. elegans,vekst ved eksponering for tunikamycin resulterer i store perturbasjoner i ER funksjon, og en betydelig redusert levetid11. Ved å måle overlevelsen av dyr på tunikamycinholdige plater, kan ER stressfølsomhet av dyr kvantifiseres. For eksempel har dyr med ektopisk UPRER induksjon og dermed økt motstand mot protein feilfolding stress i ER økt overlevelse ved tunicamycin eksponering sammenlignet med villtype dyr12.

Oksidativt og mitokondriestress påføres C. elegans ved å utsette dyr for det kjemiske middelet, paraquat. Paraquat er et vanlig ugressmiddel, noe som forårsaker superoksiddannelse spesielt i mitokondriene13. På grunn av den spesifikke lokaliseringen av mitokondrier-avledede reaktive oksygenarter (ROS), brukes paraquatanalyser ofte som en “mitokondrie” stressanalyse. Imidlertid blir superoksid raskt omdannet til hydrogenperoksid ved mitokondriesuperoksiddismutaser (SODs)14. Hydrogenperoksid kan deretter spre seg ut av mitokondriene og forårsake oksidativt stress i andre rom i cellen. Derfor beskriver vi paraquat overlevelseanalyser som målefølsomhet for både mitokondrie- og oksidativt stress (andre oksidative stressanalyser kan bli funnet15).

Termotoleranse analyser utføres i C. elegans ved å plassere dyr i forhøyede temperaturer. Omgivelsestemperaturer for nematoder er ~ 15-20 °C og termisk stress induseres ved temperaturer over 25 °C16,17. Termotoleranse analyser utføres vanligvis ved temperaturer fra 30-37 °C, da dyr viser store cellulære defekter ved denne temperaturen, og overlevelsesanalyser fullføres innen 24 timer16,18. Her er det gitt to alternative metoder for å utføre termotoleranseanalyser: vekst ved 34 °C og vekst ved 37 °C. Sammen kan protokollene som presenteres her brukes til å utføre store skjermer når de kombineres med standard genknock-down ved hjelp av RNA-interferens eller kjemiske legemiddelbiblioteker.

Protokollen kan deles inn i 4 brede prosedyrer- vekst av C. elegans og forberedelse til bildebehandling (avsnitt 1 og 2), avbildning av transkripsjonelle reportere ved hjelp av fluorescerende mikroskopi (avsnitt 3-5), kvantitative målinger av journalister ved hjelp av et cytometer for stor partikkelstrøm (avsnitt 6) og fysiologiske analyser for å måle stressfølsomhet i C. elegans (avsnitt 7).

Protocol

1. Standard vekstforhold for temperaturer og OP50 vs HT115 Standard vekst og ekspansjon Vokse en kultur av OP50 i LB (Tabell 1) eller tilsvarende media av valget for 24-48 h ved omgivelsestemperatur (~ 22-25 °C). Vokse bakterier ved romtemperatur som OP50 er en uracil auxotroph og det er en høyere forekomst av revertants (f.eks suppressor mutanter) når dyrket ved 37 °C. Langsiktig lagring av OP50 kulturer anbefales ikke (maks 1 uke ved 4 °C). Frø et volum på ~ 100-200 …

Representative Results

Bruke transkripsjonelle reportere til å måle aktivering av stressresponserHer brukes fluorescerende transkripsjonelle reportere, som fungerer som robuste verktøy for å måle aktivering av de fleste stressresponser i C. elegans. GFP-uttrykk drives under arrangøren av kanoniske mål for master transkripsjonelle regulatorer involvert i å svare på kupéspesifikke påkjenninger. En omfattende liste over vanlige transkripsjonelle reportere er tilgjengelig i …

Discussion

Her beskrives metoder for å avhøre cellulære stressresponser i C. elegans, ved hjelp av fluorescerende transkripsjonsreportere og fysiologiske stressoverlevelsesanalyser. Journalistene bruker alle GFP-uttrykk drevet under arrangøren av et nedstrøms transkripsjonsmål for transkripsjonsfaktorene som er involvert i montering av cellulære stressresponser. Bruken av hsp-4p::GFP modulert av XBP-1s-mediert UPRER, hsp-6p::GFP kontrollert av ATFS-1-mediert UPRMT, gst-4p:…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

R.BZ. støttes av EMBO langsiktig fellesskap og Larry L. Hillblom Foundation. R.H.S støttes av stipend 5F32AG032023-02 gjennom National Institute of Aging (NIA) og Glenn Foundation for Medical Research Postdoctoral Fellowship. A.F. støttes av gi F32AG051355 gjennom NIA. H.K.G. støttes av gi DGE1752814 gjennom National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program. M.G.M. støttes av 1F31AG060660-01 til og med NIA. A.D. støttes av Thomas og Stacey Siebel Foundation, Howard Hughes Medical Institute, og 4R01AG042679-04 og 5R01AG055891-02 fra NIA, og 5R01ES021667-09 fra NIEHS. Vi takker Larry Joe, Melissa Sanchez, Naame Kelet og Anel Esquivel for betydelig teknisk assistanse. Vi takker Morimoto-laboratoriet og CGC (finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Program P40 OD010440) for stammer.

Materials

Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 for mitochondrial stress
Bacto Peptone Fisher Scientific DF0118072 for NGM plates
BD Difco granulated agar VWR 90000-782 for NGM plates
Calcium chloride dihydrate VWR 97061-904 for NGM plates
Carbenicillin BioPioneer C0051-25 for RNAi
Cholesterol Sigma-Aldrich 57-88-5 for NGM plates
COPAS Biosorter Union Biometrica 350-5000-000 equipped with a 488 nm light source.
COPAS Cleaning Solution Union Biometrica 300-5072-000 to use with COPAS
COPAS Sheath Solution Union Biometrica 300-5070-100 to use with COPAS
DMSO Sigma-Aldrich 472301 solvent for drugs
IPTG dioxane free Denville Scientific CI8280-4 for RNAi
LB Broth Miller Fisher Scientific BP1426500 for LB
M205FA stereoscope Leica 10450040 equipped with a Leica DFC3000G monochromatic CCD camera, standard Leica GFP filter (ex 395-455, EM 480 LP), and LAS X software
Magnesium sulfate heptahydrate VWR EM-MX0070-3 for NGM plates, M9
Paraquat Sigma-Aldrich 36541 for oxidative/mitochondrial stress
Potassium Chloride Fisher P217-500 for bleach soluton
Potassium phosphate dibasic VWR EM-PX1570-2 for NGM plates
Potassium phosphate monobasic VWR EM-PX1565-5 for M9
Revolve ECHO 75990-514 equipped with an Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 objective lens, standard Olympus FITC filter (ex 470/40; em 525/50; DM 560), and an iPad Pro for camera and to drive ECHO software
Sodium Azide Sigma-Aldrich 71289-50G for imaging
Sodium Chloride EMD Millipore SX0420-5 for NGM plates, M9
Sodium phosphate dibasic VWR 71003-472 for M9
Tert-butyl hydroperoxide Sigma-Aldrich 458139 for oxidative stress
Tetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich T7660-5G for RNAi
Tunicamycin Sigma-Aldrich T7765-50MG for ER stress
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Higuchi-Sanabria, R., Frankino, P. A., Paul, J. W., Tronnes, S. U., Dillin, A. A Futile Battle? Protein Quality Control and the Stress of Aging. Developmental Cell. 44 (2), 139-163 (2018).
  2. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  3. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10B), 2162-2168 (2004).
  4. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  5. Reinke, S. N., Hu, X., Sykes, B. D., Lemire, B. D. Caenorhabditis elegans diet significantly affects metabolic profile, mitochondrial DNA levels, lifespan and brood size. Molecular Genetics and Metabolism. 100 (3), 274-282 (2010).
  6. Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLOS Genetics. 15 (3), e1008011 (2019).
  7. Calfon, M., et al. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA. Nature. 415 (6867), 92-96 (2002).
  8. Yoneda, T., Benedetti, C., Urano, F., Clark, S. G., Harding, H. P., Ron, D. Compartment-specific perturbation of protein handling activates genes encoding mitochondrial chaperones. Journal of Cell Science. 117 (Pt 18), 4055-4066 (2004).
  9. Link, C. D., Cypser, J. R., Johnson, C. J., Johnson, T. E. Direct observation of stress response in Caenorhabditis elegans using a reporter transgene. Cell Stress & Chaperones. 4 (4), 235-242 (1999).
  10. Heifetz, A., Keenan, R. W., Elbein, A. D. Mechanism of action of tunicamycin on the UDP-GlcNAc:dolichyl-phosphate Glc-NAc-1-phosphate transferase. Biochemistry. 18 (11), 2186-2192 (1979).
  11. Struwe, W. B., Hughes, B. L., Osborn, D. W., Boudreau, E. D., Shaw, K. M. D., Warren, C. E. Modeling a congenital disorder of glycosylation type I in C. elegans: a genome-wide RNAi screen for N-glycosylation-dependent loci. Glycobiology. 19 (12), 1554-1562 (2009).
  12. Taylor, R. C., Dillin, A. XBP-1 is a cell-nonautonomous regulator of stress resistance and longevity. Cell. 153 (7), 1435-1447 (2013).
  13. Castello, P. R., Drechsel, D. A., Patel, M. Mitochondria are a major source of paraquat-induced reactive oxygen species production in the brain. The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14186-14193 (2007).
  14. Oberley, L. W., Buettner, G. R. Role of Superoxide Dismutase in Cancer: A Review. Cancer Research. 39 (4), 1141-1149 (1979).
  15. Senchuk, M. M., Dues, D. J., Van Raamsdonk, J. M. Measuring Oxidative Stress in Caenorhabditis elegans: Paraquat and Juglone Sensitivity Assays. Bio-protocol. 7 (1), (2017).
  16. Lithgow, G. J., White, T. M., Hinerfeld, D. A., Johnson, T. E. Thermotolerance of a long-lived mutant of Caenorhabditis elegans. Journal of Gerontology. 49 (6), B270-B276 (1994).
  17. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The Biology of Proteostasis in Aging and Disease. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 435-464 (2015).
  18. Park, H. E. H., Jung, Y., Lee, S. J. V. Survival assays using Caenorhabditis elegans. Molecules and Cells. 40 (2), 90-99 (2017).
  19. Waggoner, L. E., Hardaker, L. A., Golik, S., Schafer, W. R. Effect of a Neuropeptide Gene on Behavioral States in Caenorhabditis elegans Egg-Laying. Genetics. 154 (3), 1181-1192 (2000).
  20. Durieux, J., Wolff, S., Dillin, A. The cell-non-autonomous nature of electron transport chain-mediated longevity. Cell. 144 (1), 79-91 (2011).
  21. Zevian, S. C., Yanowitz, J. L. Methodological Considerations for Heat Shock of the Nematode Caenorhabditis elegans. Methods (San Diego, Calif). 68 (3), 450-457 (2014).
  22. Shen, X., Ellis, R. E., Sakaki, K., Kaufman, R. J. Genetic interactions due to constitutive and inducible gene regulation mediated by the unfolded protein response in C. elegans. PLoS genetics. 1 (3), e37 (2005).
  23. Frakes, A. E., Dillin, A. The UPR(ER): Sensor and Coordinator of Organismal Homeostasis. Molecular Cell. 66 (6), 761-771 (2017).
  24. Martinus, R. D., et al. Selective induction of mitochondrial chaperones in response to loss of the mitochondrial genome. European Journal of Biochemistry. 240 (1), 98-103 (1996).
  25. Nargund, A. M., Pellegrino, M. W., Fiorese, C. J., Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial import efficiency of ATFS-1 regulates mitochondrial UPR activation. Science (New York, N.Y). 337 (6094), 587-590 (2012).
  26. Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial protein quality control during biogenesis and aging. Trends in Biochemical Sciences. 36 (5), 254-261 (2011).
  27. Shore, D. E., Carr, C. E., Ruvkun, G. Induction of Cytoprotective Pathways Is Central to the Extension of Lifespan Conferred by Multiple Longevity Pathways. PLOS Genetics. 8 (7), e1002792 (2012).
  28. Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497 (7450), 451-457 (2013).
  29. Chiang, S. M., Schellhorn, H. E. Regulators of oxidative stress response genes in Escherichia coli and their functional conservation in bacteria. Archives of Biochemistry and Biophysics. 525 (2), 161-169 (2012).
  30. Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology & Medicine. 88 (Pt B), 290-301 (2015).
  31. Nguyen, T., Nioi, P., Pickett, C. B. The Nrf2-antioxidant response element signaling pathway and its activation by oxidative stress. The Journal of Biological Chemistry. 284 (20), 13291-13295 (2009).
  32. Lo, J. Y., Spatola, B. N., Curran, S. P. WDR23 regulates NRF2 independently of KEAP1. PLOS Genetics. 13 (4), e1006762 (2017).
  33. Link, C., Johnson, C. Reporter Transgenes for Study of Oxidant Stress in Caenorhabditis elegans. Methods in enzymology. 353, 497-505 (2002).
  34. Choe, K. P., Przybysz, A. J., Strange, K. The WD40 Repeat Protein WDR-23 Functions with the CUL4/DDB1 Ubiquitin Ligase To Regulate Nuclear Abundance and Activity of SKN-1 in Caenorhabditis elegans. Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2704-2715 (2009).
  35. Velazquez, J. M., Lindquist, S. hsp70: nuclear concentration during environmental stress and cytoplasmic storage during recovery. Cell. 36 (3), 655-662 (1984).
  36. Tissières, A., Mitchell, H. K., Tracy, U. M. Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster: relation to chromosome puffs. Journal of Molecular Biology. 84 (3), 389-398 (1974).
  37. Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2017).
  38. Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network. PLoS genetics. 9 (4), e1003466 (2013).
  39. Hentze, N., Le Breton, L., Wiesner, J., Kempf, G., Mayer, M. P. Molecular mechanism of thermosensory function of human heat shock transcription factor Hsf1. eLife. 5, (2016).
  40. Li, J., Labbadia, J., Morimoto, R. I. Rethinking HSF1 in Stress, Development, and Organismal Health. Trends in Cell Biology. , (2017).
  41. Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 657-664 (2004).
  42. Senchuk, M. M., et al. Activation of DAF-16/FOXO by reactive oxygen species contributes to longevity in long-lived mitochondrial mutants in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 14 (3), (2018).
  43. Henderson, S. T., Bonafè, M., Johnson, T. E. daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (5), 444-460 (2006).
  44. Prahlad, V., Cornelius, T., Morimoto, R. I. Regulation of the Cellular Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans by Thermosensory Neurons. Science. 320 (5877), 811-814 (2008).
  45. Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115 (4), 489-502 (2003).
  46. Shivers, R. P., Kooistra, T., Chu, S. W., Pagano, D. J., Kim, D. H. Tissue-specific activities of an immune signaling module regulate physiological responses to pathogenic and nutritional bacteria in C. elegans. Cell Host & Microbe. 6 (4), 321-330 (2009).
  47. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Genetics. 14 (8), (2018).
  48. Glover-Cutter, K. M., Lin, S., Blackwell, T. K. Integration of the Unfolded Protein and Oxidative Stress Responses through SKN-1/Nrf. PLOS Genetics. 9 (9), e1003701 (2013).
  49. Liu, Y., Chang, A. Heat shock response relieves ER stress. The EMBO journal. 27 (7), 1049-1059 (2008).
  50. Stroustrup, N., Ulmschneider, B. E., Nash, Z. M., López-Moyado, I. F., Apfeld, J., Fontana, W. The Caenorhabditis elegans Lifespan Machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
  51. Leung, D. T. H., Chu, S. Measurement of Oxidative Stress: Mitochondrial Function Using the Seahorse System. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1710, 285-293 (2018).
  52. Morton, E. A., Lamitina, T. Caenorhabditis elegans HSF-1 is an essential nuclear protein that forms stress granule-like structures following heat shock. Aging Cell. 12 (1), 112-120 (2013).
  53. Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans. Developmental Cell. 13 (4), 467-480 (2007).
  54. Kwon, E. S., Narasimhan, S. D., Yen, K., Tissenbaum, H. A. A new DAF-16 isoform regulates longevity. Nature. 466 (7305), 498-502 (2010).
  55. An, J. H., et al. Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (45), 16275-16280 (2005).
  56. Daniele, J. R., Esping, D. J., Garcia, G., Parsons, L. S., Arriaga, E. A., Dillin, A. High-Throughput Characterization of Region-Specific Mitochondrial Function and Morphology. Scientific Reports. 7 (1), 6749 (2017).
  57. Daniele, J. R., et al. A non-canonical arm of UPRER mediates longevity through ER remodeling and lipophagy. bioRxiv. , 471177 (2018).
  58. Xu, N., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. The Journal of Cell Biology. 198 (5), 895-911 (2012).
  59. Baird, N. A., et al. HSF-1-mediated cytoskeletal integrity determines thermotolerance and life span. Science (New York, N.Y.). 346 (6207), 360-363 (2014).
  60. Higuchi-Sanabria, R., et al. Spatial regulation of the actin cytoskeleton by HSF-1 during aging. Molecular Biology of the Cell. 29 (21), 2522-2527 (2018).

Tags

C. ElegansPhysiological Stress ResponsesStress Response AssayHeat Shock ProteinEndoplasmic Reticulum Unfolded Protein ResponseGFP ReporterSodium AzideMicromanipulationHigh-throughputGenetic PerturbationsPharmacological PerturbationsMolecular And Physiological AnalysisSynchronizationImagingMicroscopy
check_url/61001?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bar-Ziv, R., Frakes, A. E., Higuchi-Sanabria, R., Bolas, T., Frankino, P. A., Gildea, H. K., Metcalf, M. G., Dillin, A. Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans. J. Vis. Exp. (159), e61001, doi:10.3791/61001 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image