Summary
تستخدم هذه الطريقة التصوير الطيفي الكتلي (MSI) لفهم عمليات التمثيل الغذائي في أوراق S. alba عند التعرض للزينوبيوتكس. تسمح هذه الطريقة بالتوطين المكاني للمركبات ذات الاهتمام ونواتج الأيض المتوقعة داخل أنسجة محددة سليمة.
Abstract
تستخدم الطريقة المقدمة التصوير الطيفي الكتلي (MSI) لتحديد الملف الأيضي لأوراق S. alba عند تعرضها للزينوبيوتكس. وباستخدام نهج غير محدد الهدف، يتم تحديد الأيض النباتي والزينوبيات ذات الأهمية وتوطينها في الأنسجة النباتية للكشف عن أنماط توزيع محددة. ثم, في التنبؤ سيليكو من الأيض المحتملة (أي, يتم تنفيذ الأيض والموارنات) من xenobiotics المحددة. عندما يقع المستقلب الزينوبيوتي في الأنسجة، يتم تسجيل نوع الإنزيم المشارك في تغيير النبات. وقد استخدمت هذه النتائج لوصف أنواع مختلفة من التفاعلات البيولوجية التي تحدث في أوراق ألبا S. استجابة لتراكم الزينوبيوتيك في الأوراق. تم التنبؤ بالميثابات في جيلين ، مما يسمح لتوثيق التفاعلات البيولوجية المتعاقبة لتحويل الزينوبيولوجيات في أنسجة الأوراق.
Introduction
يتم توزيع الزينوبيوتكس على نطاق واسع في جميع أنحاء العالم بسبب الأنشطة البشرية. بعض هذه المركبات قابلة للذوبان في الماء وتمتصها التربة1، وتدخل السلسلة الغذائية عندما تتراكم في الأنسجة النباتية2،3،4. تؤكل النباتات من قبل الحشرات والحيوانات العاشبة ، والتي هي فريسة للكائنات الحية الأخرى. وقد وصفت تناول بعض xenobiotics وتأثيرها على صحة النبات5،6،7،8، ولكن مؤخرا فقط في مستوى الأنسجة9. لذلك، فإنه لا يزال من غير الواضح أين أو كيف يحدث التمثيل الغذائي للزينوبيوتكس، أو إذا ترتبط الأيض النباتية محددة لتراكم xenobiotic في أنسجة محددة10. وعلاوة على ذلك، فإن معظم البحوث قد تجاهلت التمثيل الغذائي للxenobiotics والأيض في النباتات، لذلك لا يعرف سوى القليل عن هذه التفاعلات في الأنسجة النباتية.
المقترح هنا هو وسيلة للتحقيق في ردود الفعل الأنزيمية في العينات البيولوجية التي يمكن أن تكون مرتبطة توطين الأنسجة من الركائز والمنتجات من ردود الفعل. يمكن أن ترسم هذه الطريقة الملف الأيضي الكامل لعينة بيولوجية في تجربة واحدة ، حيث أن التحليل غير مستهدف ويمكن التحقيق فيه باستخدام قوائم مخصصة من التحليلات ذات الاهتمام. شريطة قائمة المرشحين تعقبها في مجموعة البيانات الأصلية. إذا لوحظ تحليل واحد أو عدة من الفائدة في العينة، يمكن أن يوفر توطين الأنسجة المحددة معلومات مهمة عن العمليات البيولوجية ذات الصلة. ويمكن بعد ذلك تعديل التحليلات ذات الأهمية في السيليكو باستخدام القوانين البيولوجية ذات الصلة للبحث عن المنتجات/الأيضات المحتملة. ثم يتم استخدام قائمة الأيض التي تم الحصول عليها لتحليل البيانات الأصلية من خلال تحديد الإنزيمات المعنية وتوطين ردود الفعل في الأنسجة ، مما يساعد على فهم عمليات التمثيل الغذائي التي تحدث. لا توجد طريقة أخرى توفر معلومات عن أنواع التفاعلات التي تحدث في العينات البيولوجية ، وتوطين المركبات ذات الاهتمام ، والأيض ذات الصلة. ويمكن استخدام هذه الطريقة على أي نوع من المواد البيولوجية مرة واحدة الأنسجة الطازجة وسليمة وتتوفر ويمكن أن تكون المركبات ذات الأهمية المؤينة. وقد نشر البروتوكول المقترح في فيليت وآخرونفي 12 وهو مفصل هنا لكي تستخدمه الأوساط العلمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد العينة
- الحصول على العينة البيولوجية وإما الاحتفاظ بها طازجة وسليمة (على سبيل المثال، لا تجبرها على أنبوب) أو تجميدها. وينطبق البروتوكول المقترح على أي نوع من العينات البيولوجية الصلبة (أي الأنسجة النباتية أو الحيوانية أو البشرية) لترجمة المركبات في أنسجة محددة.
- تبرد عملية قطع الباب إلى -20 درجة مئوية. حافظ على حامل العينة والشفرة في نفس درجة الحرارة.
- إذا لزم الأمر، تضمين الكائن في M1 تضمين المتوسطة للحفاظ عليه أثناء القطع.
- صب بعض مصفوفة في قالب من البلاستيك وضعت في غرفة cryomicrotome. بسرعة إضافة العينة وصب بعض أكثر تضمين المتوسطة لتغطية ذلك. الحفاظ على عينة في وسط القالب كما يتماسك مصفوفة في حين تهدئة.
ملاحظة: تضمين غير ضروري لكافة الكائنات البيولوجية. الكائنات المتجانسة مثل أدمغة الماوس لا تحتاج إلى تضمين المتوسطة ويمكن قطع المجمدة.
- صب بعض مصفوفة في قالب من البلاستيك وضعت في غرفة cryomicrotome. بسرعة إضافة العينة وصب بعض أكثر تضمين المتوسطة لتغطية ذلك. الحفاظ على عينة في وسط القالب كما يتماسك مصفوفة في حين تهدئة.
- ضع العينة المضمنة أو المجمدة على حامل cryomicrotome وقطعها بشفرة حادة. سمك 5-30 ميكرومتر جيد لعينات النباتات، والتي يصعب قطعها بسبب عدم التجانس. تكييف سمك القطع ودرجة الحرارة للعينة، مما يجعل عدة تخفيضات للعثور على أفضل الظروف. وفي المثال المقدم، قطعت العينة عند -20 درجة مئوية. فكر في إبقاء العينة تحت الصفر لتجنب تدهور العينة.
ملاحظة: يمكن أن يساعد استخدام المجهر ذو المنظار الموضوع بجوار عملية استئصال الباب التبريد في تحديد جودة الشرائح. يجب أن تبقى الأنسجة سليمة. - قم بتحريك الشريحة بعناية إلى شريحة مغلفة ب ITO باستخدام ملقط أو فرشاة طلاء صغيرة ، ثم ضع إصبعا تحت الشريحة لتسخين العينة وتجفيفها. إبقاء الشريحة في غرفة cryomicrotome حتى تكون جميع العينات جاهزة. أخرج الشريحة من الغرفة ببطء لتجنب الصدمة الحرارية.
ملاحظة: للتحقق من أي جانب من الشريحة مغلف ب ITO، ضع قطرة ماء على الشريحة في درجة حرارة الغرفة (RT). سيبقى القطرة مستديرة على الجانب المغلف ب ITO أو تتسطح على الجانب غير المصقول. - رسم علامات على الشريحة باستخدام قلم علامة رقيقة أو سائل التصحيح ومسحها ضوئيا مع ماسح ضوئي عالي الدقة قبل ترسب المصفوفة. سيتم استخدام العلامات لتحديد موضع العينة الدقيق على الشريحة عندما تكون في مطياف الكتلة. أفضل طريقة للحصول على نقاط مرجعية دقيقة هي رسم الصليب.
2. ترسب مصفوفة
- إعداد مصفوفة MALDI: تزن 70 ملغ من α-سيانو-4-هيدروكسي سيناميك (HCCA) مصفوفة وتمييعه في 10 مل من محلول الماء والميثانول (50:50) مع 0.2٪ TFA. Sonicate المصفوفة لمدة 10 دقائق في RT. قد يكون هناك مصفوفة صلبة اضافية بعد sonication.
ملاحظة: يمكن استخدام أنواع مختلفة من مصفوفات MALDI اعتمادا على التحليلات من الفائدة. - تنظيف مصفوفة ترسب الروبوت مع الميثانول 100٪.
- باستخدام الميثانول ومسح الدقة، وتنظيف الشريحة، وعقد العينات دون لمسها ودون إزالة علامات. إضافة غطاء نظيف فوق الشريحة في منطقة بدون عينة. ثم يتم وضع هذا الجزء من الشريحة على الكاشف البصري لتتبع ترسب المصفوفة.
ملاحظة: لتتبع بصريا سمك المصفوفة، يجب أن تكون الشريحة وأغطية نظيفة جدا. - استخدام الروبوت لترسب مصفوفة: ضع فقط 6 مل من محلول المصفوفة في الخزان، وإضافة 2 مل من الميثانول 100٪ لحجم إجمالي قدره 8 مل.
ملاحظة: تسجيل سمك مصفوفة على طول ترسب تلقائي ويمكن استردادها باستخدام عصا USB. لا يتم تفصيل تطوير طريقة الرش هنا.
3. الحصول على البيانات
- ضع 1 ميكرولتر من المصفوفة على لوحة MALDI لمعايرة مطياف الكتلة باستخدام قمم المصفوفة كمراجع. لا يتم تفصيل تطوير طريقة الاستحواذ على مطياف الكتلة هنا.
- إدراج لوحة MALDI في المصدر، انقر فوق"تحميل الهدف"في برنامج ftmsControl، وانتظر لوحة ليتم تحميلها.
- اختر موضع بقعة المصفوفة بالنقر على البقعة في الصورة التي تمثل لوحة MALDI.
- الإشارة إلى اسم العينة والمجلد في علامة التبويب"معلومات نموذج"من البرنامج.
- ابدأ عملية الاستحواذ بالنقر فوق"اكتساب".
- حرك اللوحة قليلا أثناء عملية الاستحواذ باستخدام مؤشر الماوس على علامة التبويب"فيديو MALDI"بحيث نقاط الليزر في بقع مختلفة.
- عند الانتهاء من عملية الاستحواذ، انتقل إلى علامة التبويب"معايرة"واختر قائمة معايرة HCCA في الوضع التربيعي وانقر فوق تلقائي. يشار إلى نتيجة المعايرة العالمية في إطار"مؤامرة المعايرة"ويجب أن تكون أقل من 0.2 ppm ل SolariX XR 7T.
- إذا كانت المعايرة جيدة، فانقر فوق"قبول"وحفظ الطريقة.
- بمجرد الانتهاء من ترسب المصفوفة على العينات، ضع الشريحة في محول الشريحة واسترجاع موضع العلامات باستخدام غطاء بلاستيكي.
- في برنامج flexImaging، قم بإعداد تشغيل تصوير جديد باستخدام النافذة الأولى التي تفتح مع البرنامج.
- قم بتسمية تشغيل التصوير، وحدد دليل النتائج، وانقر فوق التالي.
- أشر إلى حجم النقطية (أي منطقة القياس المعرفة من قبل المستخدم)، واختر الطريقة التي سيتم استخدامها (معايرة في القسم 3.1)، وانقر فوق التالي.
- تحميل الصورة البصرية للشريحة التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.6 بعد مسح الشريحة وانقر فوق التالي.
- تفتح الصورة في إطار أوسع. استخدام علامات على الشريحة لتعليم موقف الشرائح: في ftmsControl، ضع الهدف من إطار الفيديو MALDI على الموضع الدقيق للعلامة، ثم العودة إلى felxImaging وانقر على نفس النقطة بالضبط على الصورة البصرية. كرر هذا لثلاث نقاط مستقلة. يتم وضع الغطاء البلاستيكي الذي يحمل العلامات على لوحة MALDI لاستعادة موقعها وتسهيل التدريس.
ملاحظة: إذا تم إجراء العلامات مع علامة، إضافة سائل تصحيح أبيض في الجزء الخلفي من الشريحة يمكن جعلها تبرز أثناء التدريس.
- رسم المناطق ذات الاهتمام في العينات في برنامج flexImaging باستخدام"إضافة مناطق القياس"أدوات.
- حفظ تشغيل التصوير و"تسلسل AutoXecute"إذا كان العديد من العينات التي سيتم تحليلها.
- إطلاق تسلسل باستخدام"AutoXecute الدفعة عداء"إذا تم تحليل عدة عينات.
ملاحظة: مزامنة البيانات بانتظام إلى موقع آمن.
4. معالجة البيانات
- استيراد البيانات الأولية إلى برنامج التصور (مختبر SCiLS) وإنشاء مجموعة بيانات. ويتم ذلك في خطوتين منفصلتين في هذا البرنامج.
- استخدام"دفعة المستورد"أداة وحدد البيانات الخام، تشير إلى الدليل الهدف، وانقر على"استيراد".
- بعد الاستيراد، يمكن الجمع بين عدة مجموعات بيانات لمزيد من التحليل. لدمج مجموعات البيانات، استخدم"ملف| جديد| مجموعة البيانات" أداة.
- حدد نوع الأداة المستخدمة للاستحواذ، وأضف مجموعات البيانات المستوردة بالنقر فوق "+" ، ورتب الصور بالنقر فوق الكائنات وسحبها.
- تحقق من إعدادات النطاق الشامل أو قم بتعديلها إذا لزم الأمر عن طريق الإشارة إلى نطاق الاهتمام. انقر فوق التالي لمشاهدة ملخص الاستيراد ثم قم بتشغيل الاستيراد.
- تصور م / ض من الاهتمام في الأنسجة المختلفة لعينة و / أو في عينات مختلفة. ببساطة انقر على الأطياف لتحديد م / ض من الفائدة أو اكتب القيمة في مربع م / ض .
- إجراء اختبارات إحصائية إذا لزم الأمر للبحث عن قيم ضخمة أو تمييزية بين الأنسجة المختلفة و / أو عينات مختلفة لتحديد m / z من الفائدة. تتوفر الأدوات في القائمة "Tool" ولن يتم وصفها في هذا البروتوكول.
- تصدير m/z الفائدة (مثل، المركبات الضخمة والتمييزية) كملف .csv من علامة التبويب كائن. ويمكن أيضا تصدير مجموعة البيانات بأكملها إذا لم تكن كبيرة جدا (أي الحد الأقصى 60000 سطر). انقر على رمز"تصدير"على الجانب الأيمن من منطقة الاهتمام المشار إليها بسهم أحمر.
- استيراد ملف .csv لإنشاء مجموعة بيانات جديدة في برنامج التعليق التوضيحي (Metaboscape). انقر على "المشاريع | استيراد مشروع CSV". كن على علم بأنه سيتم النظر فقط في m/z بالضبط، ويتم فقدان الملف الشخصي النظيري.
ملاحظة: يسمح إصدار البرنامج 5.0 باستيراد البيانات مباشرة من برنامج التصور، مما يتيح التعليق التوضيحي الأكثر دقة، لأنه يمكن اعتبار ملف التعريف النظيري. - قم بإضافة تعليق توضيحي مع قوائم تحليل مخصصة، والتي يمكن اشتقاقها من قواعد البيانات المتاحة للجمهور. يتم إعطاء قالب بواسطة البرنامج لإنشاء قوائم تحليل.
- استخدام برنامج التنبؤ (توقع المستقلب) لأداء في التنبؤ سيليكو من الأيض من المركبات المشروحة. هناك حاجة إلى الصيغة المطورة لمجمع الفائدة ، إما رسمها المستخدم في البرنامج أو استيرادها كملف .mol. ثم الأسلوب هو بروتوكول خطوة بخطوة بسيطة.
- استرداد قائمة الأيض, إنشاء قائمة تحليل, واستخدامها في برنامج التعليق التوضيحي للتعليق على البيانات الخام مع الأيض المتوقع. بدلا من ذلك, إذا كانت قائمة الأيض قصيرة, البحث يدويا عن ذلك في الخطوة 4.8.
- تصور توزيع الأنسجة من الأيض في البيانات الخام في برنامج التصور.
- استعادة أسماء الإنزيمات المشاركة في عمليات التمثيل الغذائي في برنامج التنبؤ عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على المستقلب المتوقع من الفائدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تطبيق هذا البروتوكول على الأوراق الطازجة عينات من شجرة ألبا S. تتعرض لxenobiotics في البيئة. يتم تصوير العملية في الشكل 1. الخطوة الأولى هي إعداد شرائح رقيقة من عينة من الاهتمام. غالبا ما يكون قطع عينات النباتات أكثر صعوبة من عينات الحيوانات ، حيث أن الأنسجة غير متجانسة ويمكن أن تحتوي على الماء و / أو الهواء. تتم معالجة هذه الصعوبة باستخدام وسيط تضمين الذي يشكل كتلة متجانسة حول العينة. يتم تسهيل ترسب المصفوفة باستخدام الروبوت ، وتجنب التلاعب باليد وضمان نتائج قابلة للاستنساخ. يتم اتباع سمك طبقة مصفوفة MALDI خلال العملية بأكملها ويمكن تسجيلها. ويتطلب الحصول على البيانات تعلم كيفية التعامل مع مطياف كتلي عالي الاستبانة وتكييف الطريقة مع نوع العينات والمركبات التي يجري التحقيق فيها. يتم استيراد البيانات الخام إلى برنامج التصور للبحث عن مركبات الاهتمام وعرض توطين الأنسجة الخاصة بهم. يمكن العثور على مركبات تمييزية أو ضخمة باستخدام الأدوات الإحصائية المتاحة في البرنامج. في هذه الخطوة، فقط m/z الدقيق للمركبات معروفة. ثم يتم تصدير مركبات الاهتمام إلى برنامج التعليق التوضيحي ، والذي يمكن أن يقارن m / z بالضبط مع قائمة مخصصة من المركبات ذات الاهتمام التي يحددها المستخدم. إذا تطابق m/z بالضبط مع m/z لمجمع الفائدة، فإنه يكون مشروحا. في سياق التحقيق في الملف الأيضي ، يتم اختيار المركبات المشروحة في التنبؤ بالسيليكو للم المستقلبات. أنواع قواعد التفاعل البيولوجي المستخدمة لتوليد الأيض يتم اختيارها بسهولة من قبل المستخدم, فضلا عن عدد الأجيال التي يتم التنبؤ بها الأيض. ويمكن استخدام قائمة الأيض المتوقعة في برنامج التعليق التوضيحي للبحث عن تطابقات بين البيانات الخام بالضبط m/z والميثابات المتوقعة m/z (الشكل 1). ويمكن البحث عن المستقلبات المشروحة في برنامج التصور للحصول على توطين الأنسجة الخاصة بهم (الشكل 2). ويمكن استرداد الإنزيمات المشاركة في عملية التمثيل الغذائي للمركبات الأصلية من الفائدة لرسم ردود الفعل الأيضية التي تحدث في العينة البيولوجية (الشكل 3).
في هذا المثال، تم تحديد المخدرات telmisartan في أوراق النبات. تم توزيعه في جميع أنحاء الأنسجة. تم التنبؤ بميثابات تيلميسارتان والبحث عنها في البيانات الخام. وأظهرت الشروح أنه تم الكشف عن واحد من الجيل الأول (الأول) المستقلب في الأنسجة الداخلية للأوراق وتدهورت إلى مزيد من الجيل الثاني (الثاني) الأيض, التي كانت مترجمة في الأنسجة الداخلية أو كانت موزعة بشكل عام في جميع أنسجة الأوراق (الشكل 2). هذه النتائج تشير إلى رد فعل الأيض النشط في الأوراق لتتحلل telmisartan. تم تطبيق العملية على العديد من المركبات ذات الاهتمام المشروح في الأوراق ، وتم استرداد الإنزيمات المشاركة في ردود الفعل للتحقيق في دورها في استجابة النبات لتراكم الزينوبيوتكس. وهذا يعطي لمحة عامة عن الإنزيمات المشاركة في التمثيل الغذائي xenobiotics في أوراق ألبا S. (الشكل 3).
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 البنية العامة للطريقة. يتم قطع عينة جديدة ووضعها على شريحة مغلفة ب ITO رشها مع مصفوفة MALDI المناسبة. يوفر اكتساب MALDI بيانات أولية يمكن من خلالها ملاحظة التعريب داخل الأنسجة باستخدام برنامج مختبر SCiLS. يستخدم Metaboscape للتعليق التوضيحي، ويستخدم Metabolite Predict للتنبؤ المستقلب (أي،نواتج التنفيس والموارنة) التنبؤ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم مثال على النتائج التي تم الحصول عليها على أوراق ألبا S. يتعرض لxenobiotics. تم التعرف على Telmisartan في أوراق النبات وتصور في جميع الأنسجة. تم التنبؤ بميثبات تيلميسارتان وشرحها على البيانات الخام لتصور توطين الأنسجة الخاصة بها. تم توطين الجيل الأول (I) المستقلب C33H32N4O3 بشكل رئيسي في الأنسجة الداخلية ، في حين تم توزيع نواتج الأيض من الجيل الثاني (II) في بعض الأحيان بشكل عام. تم تعديل هذا الرقم بإذن من فيليت وآخرون12. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن لمحة انزيمية العالمية المقترحة لردود الفعل المحتملة التي تحدث في S. ألبا يترك ردا على التعرض xenobiotics. اقترح التنبؤ المستقلب والتعليق على موضوع الاهتمام ردود الفعل الأنزيمية المحتملة المسؤولة عن التمثيل الغذائي لمجمع الفائدة. تم تعديل هذا الرقم بإذن من فيليت وآخرون12. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الجزء الحاسم من هذا البروتوكول هو إعداد العينة: يجب أن تكون العينة ناعمة وسليمة. القطع هو الجزء الأكثر صعوبة، حيث أن درجة حرارة وسمك العينة يمكن أن تختلف تبعا لنوع العينة التي تمت دراستها. الأنسجة الحيوانية عادة ما تكون متجانسة وأسهل لقطع. غالبا ما تتضمن عينات النباتات هياكل مختلفة ، وبالتالي يصعب الحفاظ عليها سليمة حيث تواجه النصل أنسجة وعائية ناعمة أو صلبة أو فارغة. يوصى بشدة باستخدام الأنسجة الطازجة عند العمل مع عينات النباتات لتجنب تكوين الجليد في الأنسجة المائية وتدميرها. يجب نقل الشرائح برفق عند إيداعها على الشريحة المغلفة ب ITO. تم تخفيف مصفوفة MALDI قليلا لتجنب انسداد ورقة الرش ببلورات المصفوفة ، وهو ما يمكن أن يحدث إذا لم يتم إضافة 2 مل من الميثانول بنسبة 100٪ في الخطوة 2.4.
توفر هذه الطريقة بروتوكول إعداد عينة سهل ليوم واحد يوفر نتائج قابلة للاستنساخ بسبب استخدام الروبوت لترسب مصفوفة MALDI. ويستلزم البروتوكول المقترح الكفاءة في قطع الأنسجة وتصوير الطيف الكتلي ولا ينطبق إلا على المركبات التي يمكن تأينها. ومع ذلك، فإنه يوفر تحديد الجزيئية دون الحاجة إلى وضع العلامات كما هو مستخدم في الكيمياء المناعية11. يتم تحقيق حساسية عالية لأن المركبات تتأين مباشرة في الأنسجة أو الخلايا ، وتجنب آثار التخفيف الناتجة عن بروتوكول الاستخراج12. يتم تحليل العينات بطريقة غير مستهدفة ، مما يسمح بالتنميط على نطاق واسع للمركبات الذاتية أو الزينوبيوتية في العينات. لذلك ، يمكن اتباع الاستجابات البيولوجية للمركبات الخارجية. في التنبؤ سيليكو من الأيض إلى جانب تحليل غير المستهدفة يضيف بعدا آخر لتصوير الطيف الكتلي الكلاسيكي, لأنه يمكن رصد ردود الفعل الأيضية دون معرفة مسبقة من المركبات الخارجية التي سوف تتراكم في الأنسجة. حتى الآن، وقد اتبعت فقط المركبات المعروفة وعدد قليل من الأيض مع هذه الطريقة (على سبيل المثال، الأدوية ذات الفائدة التي تغذي الفئران)13. مع البروتوكول المقترح ، يمكن توطين المركبات الأصلية ونواتج الأيض داخل الأنسجة ، ويمكن اتباع الاستجابات البيولوجية لتراكم المركبات الخارجية و / أو المستقلبات الخاصة بها.
هذا البروتوكول لا ينطبق فقط على استجابة النباتات لxenobiotics، ولكن يمكن أيضا أن تستخدم لفهم التمثيل الغذائي الحيواني استجابة للأدوية، لمتابعة التفاعلات النباتية / الفطريات، واستجابة النبات للضغوط الحيوية أو اللاأحيائية، أو لفهم تطور الأمراض، والكشف عن عمليات التمثيل الغذائي في الأنسجة ذات الاهتمام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
نشكر تشارلز بيناو، ميلاني لاغاريغي وريجيس لافين على نصائحهم وحيلهم فيما يتعلق بإعداد العينات لتصوير MALDI لعينات النباتات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slips | Bruker Daltonics | 267942 | |
| Cryomicrotome | Thermo Scientific | ||
| Excel | Microsoft corporation | ||
| flexImaging | Bruker Daltonics | ||
| ftmsControl | Bruker Daltonics | ||
| GTX primescan | GX Microscopes | ||
| HCCA MALDI matrix | Bruker Daltonics | 8201344 | |
| ImagePrep | Bruker Daltonics | ||
| ITO-coated slides | Bruker Daltonics | 237001 | |
| M1-embedding matrix | ThermoScientific | 1310 | |
| Metabolite Predict | Bruker Daltonics | ||
| Metaboscape | Bruker Daltonics | ||
| Methanol | Fisher Chemicals | No specific reference needed | |
| MX 35 Ultra blades | Thermo Scientific | 15835682 | |
| Plastic molds | No specific reference needed | ||
| SCiLS Lab | Bruker Daltonics | ||
| SolariX XR 7Tesla | Bruker Daltonics | The method proposed is not limited to this instrument | |
| Spray sheets for ImagePrep | Bruker Daltonics | 8261614 | |
| TFA | Sigma Aldrich | No specific reference needed |
References
- Zhang, D., Gersberg, R. M., Ng, W. J., Tan, S. K. Removal of pharmaceuticals and personal care products in aquatic plant-based systems: A review. Environmental Pollution. 184, 620-639 (2014).
- Adeel, M., Song, X., Wang, Y., Francis, D., Yang, Y. Environmental impact of estrogens on human, animal and plant life: A critical review. Environment International. 99, 107-119 (2017).
- Prosser, R. S., Sibley, P. K. Human health risk assessment of pharmaceuticals and personal care products in plant tissue due to biosolids and manure amendments, and wastewater irrigation. Environment International. 75, 223-233 (2015).
- Wang, J., et al. Application of biochar to soils may result in plant contamination and human cancer risk due to exposure of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environment International. 121, 169-177 (2018).
- Marsik, P., et al. Metabolism of ibuprofen in higher plants: A model Arabidopsis thaliana cell suspension culture system. Environmental Pollution. 220, 383-392 (2017).
- He, Y., et al. Metabolism of ibuprofen by Phragmites australis: uptake and phytodegradation. Environmental Science and Technology. 51 (8), 4576-4584 (2017).
- Huber, C., Bartha, B., Harpaintner, R., Schröder, P. Metabolism of acetaminophen (paracetamol) in plants-two independent pathways result in the formation of a glutathione and a glucose conjugate. Environmental Science and Pollution Research. 16 (2), 206-213 (2009).
- Thomas, F., Cébron, A. Short-term rhizosphere effect on available carbon sources, phenanthrene degradation, and active microbiome in an aged-contaminated industrial soil. Frontiers in Microbiology. 7, 1-15 (2016).
- Villette, C., et al. In situ localization of micropollutants and associated stress response in Populus nigra leaves. Environment International. 126, 523-532 (2019).
- Sandermann, H. Plant metabolism of organic xenobiotics. Status and prospects of the 'Green Liver' concept. Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century. , 321-328 (1999).
- Sula, B., Deveci, E., Özevren, H., Ekinci, C., Elbey, B. Immunohistochemical and histopathological changes in the skin of rats after administration of lead acetate. International Journal of Morphology. 34 (3), 918-922 (2016).
- Villette, C., Maurer, L., Wanko, A., Heintz, D. Xenobiotics metabolization in Salix alba leaves uncovered by mass spectrometry imaging. Metabolomics. 15, 122 (2019).
- Khatib-Shahidi, S., Andersson, M., Herman, J. L., Gillespie, T. A., Caprioli, R. M. Direct Molecular Analysis of Whole-Body Animal Tissue Sections by Imaging MALDI Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 78 (18), 6448-6456 (2006).
