Summary
Denne metode bruger massespektrometribilleddannelse (MSI) til at forstå metaboliske processer i S. alba blade, når de udsættes for xenobiotika. Metoden gør det muligt at lokalisere forbindelser af interesse og deres forudsagte metabolitter inden for specifikke, intakte væv.
Abstract
Den fremlagte metode anvender massespektrometribilleddannelse (MSI) til at fastslå den metaboliske profil af S. alba blade, når de udsættes for xenobiotika. Ved hjælp af en ikke-målrettet tilgang identificeres og lokaliseres plantemetabolitter og xenobiotika i plantevæv for at afdække specifikke distributionsmønstre. Derefter udføres der i silicoforudsigelse af potentielle metabolitter (dvs. katabolitter og konjugatter) fra de identificerede xenobiotika. Når en xenobiotisk metabolit er placeret i vævet, registreres den type enzym, der er involveret i dens ændring af planten. Disse resultater blev brugt til at beskrive forskellige typer af biologiske reaktioner, der forekommer i S. alba blade som reaktion på xenobiotisk akkumulering i bladene. Metabolitterne blev forudsagt i to generationer, hvilket gjorde det muligt at dokumentere successive biologiske reaktioner for at omdanne xenobiotika i bladvævet.
Introduction
Xenobiotics er bredt fordelt over hele verden på grund af menneskelige aktiviteter. Nogle af disse forbindelser er vandopløselige og absorberes af jord1og kommer ind i fødekæden , når de akkumuleres i plantevæv2,3,4. Planterne spises af insekter og planteædere, som er bytte for andre organismer. Indtagelsen af nogle xenobiotika og deres indvirkning på en plantes sundhed er blevet beskrevet5,6,7,8, men først for nylig på vævsniveau9. Derfor er det stadig uklart, hvor eller hvordan metabolismen af xenobiotika opstår, eller hvis specifikke plantemetabolitter er korreleret med xenobiotisk akkumulering i specifikke væv10. Desuden har de fleste forskning overset metabolismen af xenobiotika og deres metabolitter i planter, så lidt er kendt om disse reaktioner i plantevæv.
Foreslået her er en metode til at undersøge enzymatiske reaktioner i biologiske prøver, der kan være forbundet med væv lokalisering af substrater og produkter af reaktionerne. Metoden kan tegne den komplette metaboliske profil af en biologisk prøve i et forsøg, da analysen ikke er målrettet og kan undersøges ved hjælp af brugerdefinerede lister over analysater af interesse. Forudsat er en liste over kandidater spores i det oprindelige datasæt. Hvis der noteres en eller flere analysater af interesse i prøven, kan den specifikke vævslokalisering give vigtige oplysninger om de relaterede biologiske processer. De pågældende analysikater kan derefter ændres i silico ved hjælp af relevante biologiske love for at søge efter mulige produkter /metabolitter. Listen over opnåede metabolitter bruges derefter til at analysere de oprindelige data ved at identificere de involverede enzymer og lokalisere reaktionerne i vævene og dermed hjælpe med at forstå de forekommende metaboliske processer. Ingen anden metode giver oplysninger om de typer reaktioner, der forekommer i de biologiske prøver, lokaliseringen af de forbindelser af interesse, og deres relaterede metabolitter. Denne metode kan anvendes på enhver form for biologisk materiale, når friske og intakte væv er tilgængelige, og de forbindelser af interesse kan ioniseres. Den foreslåede protokol blev offentliggjort i Villette et al.12 og er her beskrevet til brug for det videnskabelige samfund.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Prøveforberedelse
- Den biologiske prøve udtages, og den skal enten holdes frisk og intakt (f.eks. må den ikke tvinges ind i et rør) eller fryses. Den foreslåede protokol gælder for enhver form for fast biologisk prøve (dvs. plante-, dyre- eller humane væv) for at lokalisere forbindelser i specifikke væv.
- Afkøl en kryokrotom til -20 °C. Opbevar prøveholderen og klingen ved samme temperatur.
- Om nødvendigt skal du integrere objektet i M1-indlejringsmediet for at bevare det under skæring.
- Hæld nogle matrix i en plastikform placeret i cryomicrotome kammeret. Tilsæt hurtigt prøven og hæld noget mere indlejringsmedium for at dække det. Vedligehold prøven i midten af formen, da matrixen størkner under afkøling.
BEMÆRK: Indlejring er ikke nødvendig for alle biologiske objekter. Homogene objekter som musehjerner behøver ikke indlejringsmedie og kan skæres frosset.
- Hæld nogle matrix i en plastikform placeret i cryomicrotome kammeret. Tilsæt hurtigt prøven og hæld noget mere indlejringsmedium for at dække det. Vedligehold prøven i midten af formen, da matrixen størkner under afkøling.
- Placer den indlejrede eller frosne prøve på kryokrotomholderen, og skær den med et skarpt blad. En tykkelse på 5-30 μm er god til planteprøver, som er vanskelige at skære på grund af deres heterogenitet. Tilpas skæretykkelsen og temperaturen til prøven, og foretag flere snit for at finde de bedste betingelser. I det viste eksempel blev prøven skåret med -20 °C. Overvej at holde prøven under 0 °C for at undgå forringelse af prøven.
BEMÆRK: Brugen af et kikkertmikroskop placeret ved siden af kryokrotomet kan hjælpe med at bestemme kvaliteten af skiverne. Vævene skal forblive intakte. - Flyt forsigtigt skiven til et ITO-belagt dias ved hjælp af pincet eller en lille pensel, og placer derefter en finger under rutsjebanen for at varme op og tørre prøven. Hold rutsjebanen i kryokrotomkammeret, indtil alle prøver er klar. Tag glidet langsomt ud af kammeret for at undgå varmechok.
BEMÆRK: For at kontrollere, hvilken side af diaset der er ITO-belagt, skal du placere en dråbe vand på rutsjebanen ved stuetemperatur (RT). Dråben forbliver rundt på den ITO-belagte side eller flader på den ubestrøgne side. - Tegn mærker på diaset ved hjælp af en tynd tuschpen eller korrektionsvæske, og scan den med en scanner med høj opløsning, før matrixaflejringen. Mærkerne bruges til at bestemme prøvens nøjagtige position på diaset, når den er i massespektrometeret. Den bedste måde at opnå præcise referencepunkter på er at tegne et kryds.
2. Matrix deposition
- Forbered MALDI-matrixen: 70 mg α-cyano-4-hydroxycinnamicsyre (HCCA) matrix og fortynd den i 10 ml vand og methanolopløsning (50:50) med 0,2% TFA. Sonicate matrixen i 10 minutter på RT. Der kan være ekstra solid matrix efter sonikering.
BEMÆRK: Forskellige typer MALDI-matricer kan bruges afhængigt af de alysand af interesse. - Rengør matrixdepositionsrobotten med 100% methanol.
- Brug methanol og en præcisionstørring, rengør rutsjebanen, hold prøverne uden at røre ved dem og uden at fjerne mærkerne. Tilføj en ren coverlip over diaset i et område uden prøve. Den del af diaset placeres derefter over den optiske detektor for at spore matrixaflejring.
BEMÆRK: For optisk at spore matrixtykkelsen skal rutsjebanen og coverlip'en være meget ren. - Brug robotten til matrixaflejring: Placer kun 6 ml matrixopløsning i reservoiret, og tilsæt 2 ml 100% methanol for et samlet volumen på 8 ml.
BEMÆRK: Registrering af matrixtykkelse langs aflejring er automatisk og kan gendannes ved hjælp af en USB-stick. Udviklingen af en sprøjtningsmetode er ikke detaljeret her.
3. Erhvervelse af data
- Der anbringes 1 μL af matrixen på en MALDI-plade for at kalibrere massespektrometeret ved hjælp af matrixtoppene som referencer. Udviklingen af en anskaffelsesmetode på massespektrometeret er ikke detaljeret her.
- Indsæt MALDI-pladen i kilden, klik på "Load Target" i ftmsControl-software, og vent på, at pladen indlæses.
- Vælg placeringen af matrixpletten ved at klikke på stedet i det billede, der repræsenterer MALDI-pladen.
- Angiv eksempelnavnet og mappen under fanen "Eksempeloplysninger" i softwaren.
- Start anskaffelsen ved at klikke på "Anskaffelse".
- Flyt pladen en smule under anskaffelsen ved hjælp af musemarkøren på fanen "MALDI-video", så laseren peger forskellige steder.
- Når anskaffelsen er færdig, skal du gå til fanen "Kalibrering", vælge HCCA-kalibreringsliste i kvadratisk tilstand og klikke på Automatisk. Det globale kalibreringsresultat er angivet i vinduet "Kalibreringsplot" og skal være mindre end 0,2 ppm for en SolariX XR 7T.
- Hvis kalibreringen er god, skal du klikke på "Accepter" og gemme metoden.
- Når matrixaflejringen på prøverne er færdig, skal du placere diaset i en slideadapter og hente mærkernes placering ved hjælp af et plastikdæksel.
- I flexImaging software, oprette en ny billedbehandling køre ved hjælp af det første vindue, der åbner med softwaren.
- Navngiv afbildningen, vælg Resultatmappe, og klik på Næste.
- Angiv rasterstørrelsen (dvs. det brugerdefinerede måleområde), vælg den metode, der skal anvendes (kalibreret i punkt 3.1), og klik på Næste.
- Indlæs det optiske billede af det dias, der blev opnået ved trin 1.6, efter at du har scannet diaset, og klik på Næste.
- Billedet åbnes i et bredere vindue. Brug mærkerne på diaset til at undervise i diasenes placering: Placer målet for MALDI-videovinduet i ftmsControlpå den nøjagtige placering af et mærke, og kom derefter tilbage til felxImaging, og klik på nøjagtig det samme punkt på det optiske billede. Gentag dette for tre uafhængige punkter. Plastdækslet med mærkerne placeres på en MALDI-plade for at genvinde sin position og lette undervisningen.
BEMÆRK: Hvis mærkerne er lavet med en markør, kan tilføjelse af hvid korrektionsvæske bagerst på diaset få dem til at skille sig ud under undervisningen.
- Tegn de områder, der er af interesse for eksemplerne i flexImaging-softwaren, ved hjælp af værktøjerne "Tilføj måleområder".
- Gem billedseriekørslen og en "AutoXecute Sequence ",hvis flere prøver skal analyseres.
- Start en sekvens ved hjælp af "AutoXecute Batch Runner ",hvis flere prøver analyseres.
BEMÆRK: Synkroniser dataene regelmæssigt til en sikker placering.
4. Databehandling
- Importer de rå data til visualiseringssoftwaren (SCiLS Lab), og opret et datasæt. Dette gøres i to separate trin i denne software.
- Brug værktøjet "Batchimportør", vælg de rå data, angiv destinationsmappen, og klik på "Importer".
- Efter importen kan flere datasæt kombineres til yderligere analyse. Hvis du vil kombinere datasæt, skal du bruge"Filer| Ny| Datasæt" værktøj.
- Vælg den type instrument, der bruges til anskaffelse, tilføj de importerede datasæt ved at klikke på "+", og arranger billederne ved at klikke på og trække objekterne.
- Kontroller indstillingerne for masseområdet, eller rediger om nødvendigt ved at angive interesseområdet. Klik på Næste for at få vist importoversigten og starte importen.
- M/z visualiseres i de forskellige væv i en prøve og/eller i forskellige prøver. Du skal blot klikke på spektre for at vælge m / z af interesse eller skrive værdien i m / z boksen.
- Udfør statistiske test, hvis det er nødvendigt for at søge efter kolocaliserede eller diskriminerende værdier mellem forskellige væv og/eller forskellige prøver for at bestemme m/z af interesse. Værktøjerne er tilgængelige i menuen "Værktøj" og vil ikke blive beskrevet i denne protokol.
- Eksporter m/z af interesse (f.eks. kolocaliserede, diskriminerende forbindelser) som en .csv fil fra fanen Objekt. Hele datasættet kan også eksporteres, hvis det ikke er for stort (dvs. maksimalt 60.000 linjer). Klik på ikonet "Eksporter" i højre side af interesseområdet angivet med en rød pil.
- Importer .csv-filen for at oprette et nyt datasæt i anmærkningssoftwaren (Metaboscape). Klik på "Projekter | Importer CSV-projekt". Vær opmærksom på, at kun den nøjagtige m/z vil blive taget i betragtning, og at isotopprofilen går tabt.
BEMÆRK: 5.0-softwareversionen tillader direkte import af data fra visualiseringssoftwaren, hvilket muliggør en mere nøjagtig anmærkning, fordi isotopprofilen kan overvejes. - Anmærke med specialfremstillede analysandlister, som kan udledes af offentligt tilgængelige databaser. En skabelon er givet af softwaren til at oprette analysand lister.
- Brug forudsigelse software (Metabolite Predict) til at udføre i silico forudsigelse af metabolitter af kommenterede forbindelser. Den udviklede formel for renteforbindelsen er nødvendig, enten tegnet af brugeren i softwaren eller importeret som en .mol-fil. Derefter er metoden en simpel trinvis protokol.
- Gendan listen over metabolitter, opret en analysandliste, og brug den i anmærkningssoftwaren til at kommentere de rå data med forudsagte metabolitter. Alternativt, hvis listen over metabolitter er kort, manuelt søge efter det i trin 4.8.
- Visualiser vævsfordelingen af metabolitterne i de rå data i visualiseringssoftwaren.
- Gendan navnene på de enzymer, der er involveret i de metaboliske processer i forudsigelsessoftwaren, ved at højreklikke på den forudsagte metabolit af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol blev anvendt på friske blade udtaget fra en S. alba træ udsat for xenobiotika i miljøet. Processen er afbildet i figur 1. Det første skridt er at forberede tynde skiver af prøven af interesse. Planteprøver er ofte vanskeligere at skære end dyreprøver, da vævene er heterogene og kan indeholde vand og / eller luft. Denne vanskelighed håndteres ved hjælp af indlejringsmediet, som danner en homogen blok omkring prøven. Matrixaflejringen lettes ved brug af en robot, undgår håndmanipulation og sikrer reproducerbare resultater. MALDI-matrixlagets tykkelse følges under hele processen og kan registreres. Dataindsamling kræver, at man lærer at håndtere et massespektrometer med høj opløsning og tilpasse metoden til den type prøver og forbindelser, der undersøges. Rå data importeres til en visualiseringssoftware for at søge efter de interessante forbindelser og vise deres vævslokalisering. Diskriminerende eller colocalized forbindelser kan findes ved hjælp af statistiske værktøjer til rådighed i softwaren. På dette trin er kun den nøjagtige m / z af forbindelserne kendt. Renteforbindelserne eksporteres derefter til anmærkningssoftwaren, som kan sammenligne den nøjagtige m/z med en brugerdefineret liste over interesseforbindelser, der er defineret af brugeren. Hvis den nøjagtige m/z svarer til m/z for en rentes rente, kommenteres den. I forbindelse med en metabolisk profilundersøgelse udvælges de kommenterede forbindelser til silicoforudsigelse af metabolitter. De typer af biologiske reaktionsregler, der anvendes til at generere metabolitter, vælges let af brugeren, samt antallet af generationer, over hvilke metabolitterne forudsiges. Listen over forudsagte metabolitter kan bruges i anmærkningssoftwaren til at søge efter match mellem nøjagtige rådata m/z og forudsagte metabolitter m/z (figur 1). De kommenterede metabolitter kan søges i visualiseringssoftwaren for at få deres vævslokalisering (Figur 2). De enzymer, der er involveret i metabolismen af de oprindelige interesseforbindelser, kan genvindes for at tegne de metaboliske reaktioner, der forekommer i den biologiske prøve (figur 3).
I dette eksempel blev stoffet telmisartan identificeret i plantebladene; det blev fordelt over hele vævene. Telmisartans metabolitter blev forudsagt og søgt efter i de rå data. Anmærkningerne viste, at en førstegenerations (I) metabolit blev påvist i bladenes indre væv og yderligere nedbrudt til andengenerations (II) metabolitter, som var lokaliseret i indre væv eller mere generelt blev distribueret i alle bladvæv (Figur 2). Disse resultater tyder på en aktiv metabolisk reaktion i bladene til at nedbryde telmisartan. Processen blev anvendt på flere forbindelser af interesse kommenteret i bladene, og de enzymer, der er involveret i reaktionerne, blev genvundet for at undersøge deres rolle i plantens reaktion på xenobiotikaakkumulering. Dette giver et overblik over de enzymer, der er involveret i xenobiotikametabolisme i S. alba blade (Figur 3).
Figur 1. Metodens generelle struktur. En ny prøve skæres og placeres på en ITO-belagt rutsjebane sprøjtes med den relevante MALDI-matrix. MALDI-erhvervelsen giver rå data, hvorfra lokaliseringen i vævet kan observeres med SCiLS Lab-softwaren. Metaboscape bruges til anmærkning, og Metabolit Predict bruges til metabolit (dvs. katabolitter og konjugatter) forudsigelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Eksempel på de resultater, der er opnået på S. alba blade udsat for xenobiotika. Telmisartan blev identificeret i plantebladene og visualiseret i alle væv. Telmisartan metabolitter blev forudsagt og kommenteret på de rå data til at visualisere deres væv lokalisering. Førstegenerationsmetabolitten C33H32N4O3 var hovedsageligt lokaliseret i det indre væv, mens andengenerationsmetabolitter (II) undertiden blev mere generelt fordelt. Dette tal blev tilpasset med tilladelse fra Villette et al.12. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Global enzymatisk profil foreslået for potentielle reaktioner, der forekommer i S. alba blade som reaktion på xenobiotics eksponering. Metabolittens forudsigelse og anmærkning på genstanden for interesse tydede på de potentielle enzymatiske reaktioner, der er ansvarlige for metabolismen af interessentsammenhængen. Dette tal blev tilpasset med tilladelse fra Villette et al.12. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den kritiske del af denne protokol er prøveforberedelsen: Prøven skal være blød og intakt. Skæring er den sværeste del, da prøvens temperatur og tykkelse kan variere afhængigt af den undersøgte type prøve. Dyrevæv er normalt homogene og lettere at skære. Planteprøver indeholder ofte forskellige strukturer og er derfor vanskeligere at holde intakte, da bladet støder på blødt, hårdt eller tomt vaskulært væv. Det anbefales stærkt at bruge frisk væv, når du arbejder med planteprøver for at undgå dannelse af is i det hydrofile væv og deres ødelæggelse. Skiverne skal flyttes forsigtigt, når de lægges på den ITO-belagte rutsjebane. MALDI-matrixen blev lidt fortyndet for at undgå tilstopning af sprøjtepladen med matrixkrystaller, hvilket kan ske, hvis 2 mL på 100% methanol ikke tilsættes ved trin 2.4.
Denne metode tilbyder en nem endags prøveforberedelsesprotokol, der giver reproducerbare resultater på grund af brugen af en robot til MALDI-matrixaflejring. Den foreslåede protokol kræver kompetence inden for vævsskæring og massespektrometribilleddannelse og gælder kun for forbindelser, der kan ioniseres. Den giver imidlertid molekylær identifikation uden behov for mærkning som anvendt i immunhistokemi11. Høj følsomhed opnås, fordi forbindelserne er direkte ioniseret i væv eller celler, så fortyndingseffekter, der produceres af en ekstraktionsprotokol12, undgås . Prøverne analyseres på en ikke-målrettet måde, hvilket giver mulighed for en storstilet profilering af de endogene eller xenobiotikaforbindelser i prøverne. Derfor kan biologiske reaktioner på eksogene forbindelser følges. In silicoforudsigelsen af metabolitter kombineret med ikke-målrettet analyse tilføjer en anden dimension til klassisk massespektrometribilleddannelse, fordi metaboliske reaktioner kan overvåges uden forudgående kendskab til de eksogene forbindelser, der vil ophobes i vævene. Til dato er kun kendte forbindelser og nogle få metabolitter blevet fulgt med denne metode (f.eks. lægemidler af interesse, der fodres med rotter)13. Med den foreslåede protokol kan de oprindelige forbindelser og deres metabolitter lokaliseres i vævene, og de biologiske reaktioner på akkumulering af eksogene forbindelser og / eller deres metabolitter kan følges.
Denne protokol gælder ikke kun for planters reaktion på xenobiotika, men kan også bruges til at forstå dyrs stofskifte som reaktion på lægemidler, til at følge plante / svampe interaktioner, planterespons på biotiske eller abiotiske belastninger eller til at forstå udviklingen af sygdomme, der afslører de metaboliske processer i de væv af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Charles Pineau, Mélanie Lagarrigue og Régis Lavigne for deres tips og tricks vedrørende prøveforberedelse til MALDI-billeddannelse af planteprøver.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slips | Bruker Daltonics | 267942 | |
| Cryomicrotome | Thermo Scientific | ||
| Excel | Microsoft corporation | ||
| flexImaging | Bruker Daltonics | ||
| ftmsControl | Bruker Daltonics | ||
| GTX primescan | GX Microscopes | ||
| HCCA MALDI matrix | Bruker Daltonics | 8201344 | |
| ImagePrep | Bruker Daltonics | ||
| ITO-coated slides | Bruker Daltonics | 237001 | |
| M1-embedding matrix | ThermoScientific | 1310 | |
| Metabolite Predict | Bruker Daltonics | ||
| Metaboscape | Bruker Daltonics | ||
| Methanol | Fisher Chemicals | No specific reference needed | |
| MX 35 Ultra blades | Thermo Scientific | 15835682 | |
| Plastic molds | No specific reference needed | ||
| SCiLS Lab | Bruker Daltonics | ||
| SolariX XR 7Tesla | Bruker Daltonics | The method proposed is not limited to this instrument | |
| Spray sheets for ImagePrep | Bruker Daltonics | 8261614 | |
| TFA | Sigma Aldrich | No specific reference needed |
References
- Zhang, D., Gersberg, R. M., Ng, W. J., Tan, S. K. Removal of pharmaceuticals and personal care products in aquatic plant-based systems: A review. Environmental Pollution. 184, 620-639 (2014).
- Adeel, M., Song, X., Wang, Y., Francis, D., Yang, Y. Environmental impact of estrogens on human, animal and plant life: A critical review. Environment International. 99, 107-119 (2017).
- Prosser, R. S., Sibley, P. K. Human health risk assessment of pharmaceuticals and personal care products in plant tissue due to biosolids and manure amendments, and wastewater irrigation. Environment International. 75, 223-233 (2015).
- Wang, J., et al. Application of biochar to soils may result in plant contamination and human cancer risk due to exposure of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environment International. 121, 169-177 (2018).
- Marsik, P., et al. Metabolism of ibuprofen in higher plants: A model Arabidopsis thaliana cell suspension culture system. Environmental Pollution. 220, 383-392 (2017).
- He, Y., et al. Metabolism of ibuprofen by Phragmites australis: uptake and phytodegradation. Environmental Science and Technology. 51 (8), 4576-4584 (2017).
- Huber, C., Bartha, B., Harpaintner, R., Schröder, P. Metabolism of acetaminophen (paracetamol) in plants-two independent pathways result in the formation of a glutathione and a glucose conjugate. Environmental Science and Pollution Research. 16 (2), 206-213 (2009).
- Thomas, F., Cébron, A. Short-term rhizosphere effect on available carbon sources, phenanthrene degradation, and active microbiome in an aged-contaminated industrial soil. Frontiers in Microbiology. 7, 1-15 (2016).
- Villette, C., et al. In situ localization of micropollutants and associated stress response in Populus nigra leaves. Environment International. 126, 523-532 (2019).
- Sandermann, H. Plant metabolism of organic xenobiotics. Status and prospects of the 'Green Liver' concept. Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century. , 321-328 (1999).
- Sula, B., Deveci, E., Özevren, H., Ekinci, C., Elbey, B. Immunohistochemical and histopathological changes in the skin of rats after administration of lead acetate. International Journal of Morphology. 34 (3), 918-922 (2016).
- Villette, C., Maurer, L., Wanko, A., Heintz, D. Xenobiotics metabolization in Salix alba leaves uncovered by mass spectrometry imaging. Metabolomics. 15, 122 (2019).
- Khatib-Shahidi, S., Andersson, M., Herman, J. L., Gillespie, T. A., Caprioli, R. M. Direct Molecular Analysis of Whole-Body Animal Tissue Sections by Imaging MALDI Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 78 (18), 6448-6456 (2006).
