Summary
Этот метод использует масс-спектрометрическую визуализацию (MSI) для понимания метаболических процессов в листьях S. alba при воздействии ксенобиотиков. Метод позволяет пространственно локализовать интересующих соединений и их прогнозируемые метаболиты в пределах специфических, интактных тканей.
Abstract
Представленный способ использует масс-спектрометрическую визуализацию (MSI) для установления метаболического профиля листьев S. alba при воздействии ксенобиотиков. Используя нецелевой подход, растительные метаболиты и ксенобиотики, представляющие интерес, идентифицируются и локализуются в тканях растений для выявления конкретных моделей распределения. Затем in silico выполняется прогнозирование потенциальных метаболитов (т.е. катаболитов и конъюгатов) из идентифицированных ксенобиотиков. Когда ксенобиотический метаболит находится в ткани, регистрируется тип фермента, участвующего в его изменении растением. Эти результаты были использованы для описания различных типов биологических реакций, происходящих в листьях S. alba в ответ на накопление ксенобиотиков в листьях. Метаболиты были предсказано в двух поколениях, что позволило документировать последовательные биологические реакции для преобразования ксенобиотиков в тканях листьев.
Introduction
Ксенобиотики широко распространены по всему миру благодаря деятельности человека. Некоторые из этих соединений являются водорастворимыми и поглощаются почвой1,и попадают в пищевую цепь при накоплении в тканях растений2,3,4. Растения поедаются насекомыми и травоядными животными, которые являются добычей других организмов. Прием некоторых ксенобиотиков и их влияние на здоровье растения были описаны5,6,7,8,но только недавно на тканевом уровне9. Поэтому до сих пор неясно, где и как происходит метаболизм ксенобиотиков, или коррелируют ли специфические растительные метаболиты с накоплением ксенобиотиков в конкретных тканях10. Более того, большинство исследований упускают из виду метаболизм ксенобиотиков и их метаболитов в растениях, поэтому мало что известно об этих реакциях в тканях растений.
Предложен способ исследования ферментативных реакций в биологических образцах, которые могут быть связаны с тканевой локализацией субстратов и продуктов реакций. Метод может нарисовать полный метаболический профиль биологического образца в одном эксперименте, так как анализ не является целевым и может быть исследован с использованием пользовательских списков интересующих аналитов. Предоставляется список кандидатов, отслеживаемых в исходном наборе данных. Если в образце отмечен один или несколько интересующих аналитов, конкретная локализация ткани может предоставить важную информацию о связанных биологических процессах. Интересуемые аналиты затем могут быть модифицированы in silico с использованием соответствующих биологических законов для поиска возможных продуктов/метаболитов. Полученный список метаболитов затем используется для анализа исходных данных путем идентификации вовлеченных ферментов и локализации реакций в тканях, тем самым помогая понять происходящие метаболические процессы. Ни один другой метод не предоставляет информацию о типах реакций, происходящих в биологических образцах, локализации интересующих соединений и связанных с ними метаболитах. Этот метод может быть использован на любом типе биологического материала, как только свежие и неповрежденные ткани доступны, а представляющие интерес соединения могут быть ионизированы. Предлагаемый протокол был опубликован в Villette et al.12 и подробно описан здесь для использования научным сообществом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Пробоподготовка
- Получите биологический образец и либо сохраните его свежим и неповрежденным (например, не заставляйте его в пробирку), либо заморозьте его. Предлагаемый протокол применяется к любому типу твердого биологического образца (т.е. растительных, животных или тканей человека) для локализации соединений в конкретных тканях.
- Охладить криомикротом до -20 °C. Держите держатель образца и лезвие при одинаковой температуре.
- При необходимости встраивают объект во встраиваемую среду М1 для сохранения его во время резки.
- Вылейте немного матрицы в пластиковую форму, помещенную в криомикротомную камеру. Быстро добавьте образец и залейте еще немного встраиваемой среды, чтобы покрыть его. Поддерживайте образец в центре формы, когда матрица затвердевет при охлаждении.
ПРИМЕЧАНИЕ: Встраивание не является необходимым для всех биологических объектов. Однородные объекты, такие как мозг мыши, не нуждаются во встраивающей среде и могут быть заморожены.
- Вылейте немного матрицы в пластиковую форму, помещенную в криомикротомную камеру. Быстро добавьте образец и залейте еще немного встраиваемой среды, чтобы покрыть его. Поддерживайте образец в центре формы, когда матрица затвердевет при охлаждении.
- Поместите внедренный или замороженный образец на держатель криомикротома и вырежьте его острым лезвием. Толщина 5–30 мкм хороша для образцов растений, которые трудно обрезать из-за их неоднородности. Адаптируйте толщину и температуру резания к образцу, сделав несколько разрезов, чтобы найти наилучшие условия. В приведенном примере образец разрезали при -20°C. Рассмотрите возможность сохранения образца при 0 °C, чтобы избежать деградации образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование бинокулярного микроскопа, размещенного рядом с криомикротомом, может помочь определить качество срезов. Ткани должны оставаться нетронутыми. - Осторожно переместите срез на слайд, покрытый ITO, с помощью щипцов или небольшой кисти, затем поместите палец под слайд, чтобы разогреть и высушить образец. Держите слайд в криомикротомной камере до тех пор, пока все образцы не будут готовы. Медленно вынимайте затвор из камеры, чтобы избежать теплового удара.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы проверить, какая сторона горки покрыта ITO, поместите каплю воды на горку при комнатной температуре (RT). Капля останется круглой на стороне с покрытием ITO или сплющенной на стороне без покрытия. - Нарисуйте метки на слайде с помощью тонкого маркерного пера или корректирующей жидкости и отсканируйте его с помощью сканера высокого разрешения перед наложением матрицы. Метки будут использоваться для определения точного положения образца на слайде, когда он находится в масс-спектрометре. Лучший способ получить точные точки отсчета — нарисовать крест.
2. Матричное осаждение
- Приготовьте матрицу MALDI: взвесьте 70 мг матрицы α-циан-4-гидроксициннамовой кислоты (HCCA) и разбавьте ее в 10 мл раствора воды и метанола (50:50) с 0,2% TFA. Обуславливать матрицу ультразвуком в течение 10 минут на RT. После ультразвуковой обивки может появиться сверхтвердая матрица.
ПРИМЕЧАНИЕ: Различные типы матриц MALDI могут быть использованы в зависимости от интересующих аналитов. - Очистите матрицу робота для осаждения 100% метанолом.
- Используя метанол и прецизионную протирку, очистите слайд, удерживая образцы, не прикасаясь к ним и не удаляя следы. Добавьте чистый обтекаемый лист поверх слайда в области без образца. Эта часть слайда затем помещается над оптическим детектором для отслеживания матричного осаждения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптического отслеживания толщины матрицы слайд и крышка должны быть очень чистыми. - Используйте робота для матричного осаждения: поместите в резервуар только 6 мл матричного раствора и добавьте 2 мл 100% метанола на общий объем 8 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Запись толщины матрицы вдоль осаждения происходит автоматически и может быть восстановлена с помощью USB-накопителя. Разработка метода распыления здесь не детализирована.
3. Сбор данных
- Поместите 1 мкл матрицы на пластину MALDI для калибровки масс-спектрометра, используя матричные пики в качестве эталонов. Разработка метода сбора на масс-спектрометре здесь не детализирована.
- Вставьте пластину MALDI в источник, нажмите«Load Target»в программном обеспечении ftmsControl и дождитесь загрузки пластины.
- Выберите положение пятна матрицы, щелкнув по месту на изображении, представляющем пластину MALDI.
- Укажите имя образца и папку на вкладке"Сведения об образце"программного обеспечения.
- Начните приобретение, нажав кнопку«Приобретение».
- Слегка переместите пластину во время захвата с помощью указателя мыши на вкладке«MALDI video»так, чтобы лазер указывал на разные места.
- Когда сбор будет завершен, перейдите на вкладку«Калибровка»,выберите список калибровки HCCA в квадратичном режиме и нажмите «Автоматически». Глобальный результат калибровки указывается в окне«Калибровочная диаграмма»и должен быть менее 0,2 ppm для SolariX XR 7T.
- Если калибровка хорошая, нажмите«Принять»и сохраните метод.
- После завершения матричного осаждения на образцах поместите слайд в адаптер для слайдов и извлеките положение меток с помощью пластиковой крышки.
- В программном обеспечении flexImaging настройте новый запуск образа с помощью первого окна, которое откроется вместе с программным обеспечением.
- Присвойте имя запуску образа, выберите каталог результатови нажмите кнопку Далее.
- Укажите размер растров (т.е. определяемую пользователем область измерения), выберите используемый метод (откалиброванный в разделе 3.1) и нажмите кнопку Далее.
- Загрузите оптическое изображение слайда, полученное на шаге 1.6, после сканирования слайда и нажмите кнопку Далее.
- Изображение откроется в более широком окне. Используйте метки на слайде, чтобы научить положению слайдов: в ftmsControlпоместите цель видеоокна MALDI на точное положение метки, затем вернитесь в felxImaging и нажмите на ту же точку на оптическом изображении. Повторите это для трех независимых точек. Пластиковая крышка с маркировкой помещается на пластину MALDI, чтобы восстановить свое положение и облегчить обучение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если отметки были сделаны маркером, добавление белой корректировочной жидкости в задней части слайда может выделить их во время обучения.
- Нарисуйте интересующие области в образцах в программном обеспечении flexImaging с помощью инструментов«Добавление областей измерения».
- Сохраните запуск образа ипоследовательность AutoXecute,если необходимо проанализировать несколько образцов.
- Запустите последовательность с помощью"AutoXecute Batch Runner",если проанализировано несколько образцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Регулярно синхронизируйте данные с безопасным местом.
4. Обработка данных
- Импортируйте необработанные данные в программное обеспечение визуализации (SCiLS Lab) и создайте набор данных. Это делается в два отдельных шага в этом программном обеспечении.
- Используйте инструмент«Batch Importer»и выберите необработанные данные, укажите целевой каталог и нажмите«Импорт».
- После импорта можно объединить несколько наборов данных для дальнейшего анализа. Для объединения наборов данных используйте параметр"Файл| Новинка| Набор данных".
- Выберите тип инструмента, используемого для сбора, добавьте импортированные наборы данных, нажав кнопку «+», и упорядочить изображения, щелкнув и перетащив объекты.
- Проверьте настройки диапазона масс или при необходимости измените его, указав интересующий диапазон. Нажмите кнопку Далее, чтобы просмотреть сводку импорта и запустить импорт.
- Визуализируйте m/z интереса в различных тканях образца и/или в разных образцах. Просто нажмите на спектры, чтобы выбрать интересующих m/z или введите значение в поле m/z.
- Выполняйте статистические тесты, если это необходимо для поиска колокализованных или дискриминативных значений между различными тканями и / или различными образцами, чтобы определить интересующее м/з. Инструменты доступны в меню«Инструмент»и не будут описаны в этом протоколе.
- Экспортируйте интересующих m/z (например, колокализованные, дискриминирующие соединения) в виде файла .csv с вкладки Объект. Весь набор данных также может быть экспортирован, если он не слишком велик (т. Е. Максимум 60 000 строк). Нажмите на значок«Экспорт»в правой части интересуемой области, обозначенной красной стрелкой.
- Импортируйте файл .csv, чтобы создать новый набор данных в программном обеспечении для аннотаций (Metaboscape). Нажмите на "Проекты | Импорт CSV проекта". Имейте в виду, что будет учитываться только точный m/z, и изотопный профиль будет потерян.
ПРИМЕЧАНИЕ: Версия программного обеспечения 5.0 позволяет напрямую импортировать данные из программного обеспечения визуализации, что позволяет более точно аннотировать, поскольку можно рассмотреть изотопный профиль. - Аннотировать с помощью пользовательских списков анализируемых материалов, которые могут быть получены из общедоступных баз данных. Шаблон предоставляется программным обеспечением для создания списков анализируемых материалов.
- Используйте программное обеспечение для прогнозирования (Metabolite Predict) для выполнения in silico прогнозирования метаболитов аннотированных соединений. Необходима разработанная формула соединения процентов, либо нарисованная пользователем в программном обеспечении, либо импортированная в виде файла .mol. Тогда метод представляет собой простой пошаговый протокол.
- Восстановите список метаболитов, создайте список анализируемых и используйте его в программном обеспечении для аннотаций для аннотирования необработанных данных с предсказанными метаболитами. Альтернативно, если список метаболитов короткий, вручную выполните поиск на шаге 4.8.
- Визуализируйте тканевое распределение метаболитов в необработанных данных в программном обеспечении визуализации.
- Восстановите названия ферментов, участвующих в метаболических процессах, в программном обеспечении прогнозирования, щелкнув правой кнопкой мыши на прогнозируемом метаболите, представляющим интерес.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол был применен к свежим листьям, отобранным из дерева S. alba, подвергаемого воздействию ксенобиотиков в окружающей среде. Процесс показан на рисунке 1. Первым шагом является приготовление тонких кусочков интересуемого образца. Образцы растений часто труднее разрезать, чем образцы животных, поскольку ткани неоднородны и могут содержать воду и / или воздух. Эта трудность решается с помощью встраиваемой среды, которая образует однородный блок вокруг образца. Матричное осаждение облегчается использованием робота, что позволяет избежать манипуляций с руками и обеспечить воспроизводимые результаты. Толщина слоя матрицы MALDI соблюдается в течение всего процесса и может быть записана. Сбор данных требует обучения обращению с масс-спектрометром высокого разрешения и адаптации метода к типу исследуемых образцов и соединений. Необработанные данные импортируются в программное обеспечение визуализации для поиска интересующих соединений и отображения их тканевой локализации. Дискриминирующие или колокализованные соединения можно найти с помощью статистических инструментов, доступных в программном обеспечении. На этом этапе известны только точные m/z соединений. Затем интересуемые соединения экспортируются в программное обеспечение для аннотаций, которое может сравнивать точный m/z с пользовательским списком интересующих соединений, определенным пользователем. Если точное m/z совпадает с m/z процентного соединения, оно аннотируется. В контексте исследования метаболического профиля аннотированные соединения отбираются для in silico прогнозирования метаболитов. Типы правил биологических реакций, используемых для генерации метаболитов, легко выбираются пользователем, а также количество поколений, на которые прогнозируются метаболиты. Список прогнозируемых метаболитов может быть использован в программном обеспечении для аннотаций для поиска совпадений между необработанными данными точного m/z и предсказанных метаболитов m/z (рисунок 1). Аннотированные метаболиты можно искать в программном обеспечении визуализации для получения их тканевой локализации(рисунок 2). Ферменты, участвующие в метаболизме исходных соединений, представляющих интерес, могут быть восстановлены для извлечения метаболических реакций, происходящих в биологическом образце(рисунок 3).
В этом примере препарат телмисартан был идентифицирован в листьях растений; она распределялась по тканям. Метаболиты Телмисартана были предсказаны и искались в необработанных данных. Аннотации показали, что один метаболит первого поколения (I) был обнаружен во внутренних тканях листьев и далее деградировал в метаболиты второго поколения (II), которые локализовались во внутренних тканях или были более распространены во всех тканях листьев(Рисунок 2). Эти результаты свидетельствуют об активной метаболической реакции в листьях с целью разложения телмисартана. Процесс был применен к нескольким представляющим интерес соединениям, аннотированным в листьях, и ферменты, участвующие в реакциях, были восстановлены, чтобы исследовать их роль в реакции растения на накопление ксенобиотиков. Это дает обзор ферментов, участвующих в метаболизме ксенобиотиков в листьях S. alba (рисунок 3).
Рисунок 1. Общая структура метода. Свежий образец разрезается и помещается на слайд с покрытием ITO, распыляемый соответствующей матрицей MALDI. Получение MALDI предоставляет необработанные данные, из которых можно наблюдать локализацию в ткани с помощью программного обеспечения SCiLS Lab. Metaboscape используется для аннотации, а Metabolite Predict используется для прогнозирования метаболитов (т.е. катаболитов и конъюгатов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Пример результатов, полученных на листьях S. alba, подвергшихся воздействию ксенобиотиков. Телмисартан был идентифицирован в листьях растения и визуализирован во всех тканях. Метаболиты телмисартана были предсказаны и аннотированы на исходных данных для визуализации их тканевой локализации. Метаболит первого поколения (I) C33H32N4O3 локализовался в основном во внутренних тканях, в то время как метаболиты второго поколения (II) иногда распределялись более широко. Эта цифра была адаптирована с разрешения Villette et al.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Предложен глобальный ферментативный профиль для потенциальных реакций, происходящих в листьях S. alba в ответ на воздействие ксенобиотиков. Предсказание метаболита и аннотация на интересуемом объекте предполагали потенциальные ферментативные реакции, ответственные за метаболизм интересующего соединения. Эта цифра была адаптирована с разрешения Villette et al.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Важнейшей частью этого протокола является пробоподготовка: образец должен быть мягким и неповрежденным. Резка является наиболее сложной частью, так как температура и толщина образца могут варьироваться в зависимости от типа исследуемого образца. Ткани животных обычно однородны и их легче разрезать. Образцы растений часто включают различные структуры и, следовательно, их труднее сохранить нетронутыми, поскольку лезвие сталкивается с мягкими, твердыми или пустыми сосудистыми тканями. Настоятельно рекомендуется использовать свежие ткани при работе с образцами растений, чтобы избежать образования льда в гидрофильных тканях и их разрушения. Срезы необходимо осторожно перемещать при нанесении на слайд с покрытием ITO. Матрицу MALDI слегка разбавляли, чтобы избежать засорения распылительного листа кристаллами матрицы, что может произойти, если 2 мл 100% метанола не добавляют на этапе 2.4.
Этот метод предлагает простой однодневный протокол подготовки образцов, который обеспечивает воспроизводимые результаты благодаря использованию робота для осаждения матрицы MALDI. Предлагаемый протокол требует компетентности в области разрезания тканей и масс-спектрометрии и применяется только к соединениям, которые могут быть ионизированы. Тем не менее, он обеспечивает молекулярную идентификацию без необходимости маркировки, используемой в иммуногистохимии11. Высокая чувствительность достигается за счет того, что соединения непосредственно ионизируются в тканях или клетках, избегая эффектов разбавления, производимых протоколом экстракции12. Образцы анализируются нецелевым способом, что позволяет проводить крупномасштабное профилирование эндогенных или ксенобиотических соединений в образцах. Поэтому можно проследить биологические реакции на экзогенные соединения. Прогнозирование in silico метаболитов в сочетании с нецелевым анализом добавляет еще одно измерение к классической масс-спектрометрической визуализации, поскольку метаболические реакции можно контролировать без априорного знания экзогенных соединений, которые будут накапливаться в тканях. На сегодняшний день только известные соединения и несколько метаболитов были использованы с помощью этого метода (например, препараты, представляющие интерес для крыс)13. С помощью предлагаемого протокола исходные соединения и их метаболиты могут быть локализованы в тканях, и могут быть продолжены биологические реакции на накопление экзогенных соединений и/или их метаболитов.
Этот протокол не только применяется к реакции растений на ксенобиотики, но также может быть использован для понимания метаболизма животных в ответ на лекарства, для отслеживания взаимодействия растений / грибов, реакции растений на биотические или абиотические стрессы или для понимания эволюции заболеваний, выявляя метаболические процессы в интересующих тканях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Шарля Пино, Мелани Лагарриг и Режиса Лавиня за их советы и рекомендации по подготовке образцов для визуализации образцов растений MALDI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slips | Bruker Daltonics | 267942 | |
| Cryomicrotome | Thermo Scientific | ||
| Excel | Microsoft corporation | ||
| flexImaging | Bruker Daltonics | ||
| ftmsControl | Bruker Daltonics | ||
| GTX primescan | GX Microscopes | ||
| HCCA MALDI matrix | Bruker Daltonics | 8201344 | |
| ImagePrep | Bruker Daltonics | ||
| ITO-coated slides | Bruker Daltonics | 237001 | |
| M1-embedding matrix | ThermoScientific | 1310 | |
| Metabolite Predict | Bruker Daltonics | ||
| Metaboscape | Bruker Daltonics | ||
| Methanol | Fisher Chemicals | No specific reference needed | |
| MX 35 Ultra blades | Thermo Scientific | 15835682 | |
| Plastic molds | No specific reference needed | ||
| SCiLS Lab | Bruker Daltonics | ||
| SolariX XR 7Tesla | Bruker Daltonics | The method proposed is not limited to this instrument | |
| Spray sheets for ImagePrep | Bruker Daltonics | 8261614 | |
| TFA | Sigma Aldrich | No specific reference needed |
References
- Zhang, D., Gersberg, R. M., Ng, W. J., Tan, S. K. Removal of pharmaceuticals and personal care products in aquatic plant-based systems: A review. Environmental Pollution. 184, 620-639 (2014).
- Adeel, M., Song, X., Wang, Y., Francis, D., Yang, Y. Environmental impact of estrogens on human, animal and plant life: A critical review. Environment International. 99, 107-119 (2017).
- Prosser, R. S., Sibley, P. K. Human health risk assessment of pharmaceuticals and personal care products in plant tissue due to biosolids and manure amendments, and wastewater irrigation. Environment International. 75, 223-233 (2015).
- Wang, J., et al. Application of biochar to soils may result in plant contamination and human cancer risk due to exposure of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environment International. 121, 169-177 (2018).
- Marsik, P., et al. Metabolism of ibuprofen in higher plants: A model Arabidopsis thaliana cell suspension culture system. Environmental Pollution. 220, 383-392 (2017).
- He, Y., et al. Metabolism of ibuprofen by Phragmites australis: uptake and phytodegradation. Environmental Science and Technology. 51 (8), 4576-4584 (2017).
- Huber, C., Bartha, B., Harpaintner, R., Schröder, P. Metabolism of acetaminophen (paracetamol) in plants-two independent pathways result in the formation of a glutathione and a glucose conjugate. Environmental Science and Pollution Research. 16 (2), 206-213 (2009).
- Thomas, F., Cébron, A. Short-term rhizosphere effect on available carbon sources, phenanthrene degradation, and active microbiome in an aged-contaminated industrial soil. Frontiers in Microbiology. 7, 1-15 (2016).
- Villette, C., et al. In situ localization of micropollutants and associated stress response in Populus nigra leaves. Environment International. 126, 523-532 (2019).
- Sandermann, H. Plant metabolism of organic xenobiotics. Status and prospects of the 'Green Liver' concept. Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century. , 321-328 (1999).
- Sula, B., Deveci, E., Özevren, H., Ekinci, C., Elbey, B. Immunohistochemical and histopathological changes in the skin of rats after administration of lead acetate. International Journal of Morphology. 34 (3), 918-922 (2016).
- Villette, C., Maurer, L., Wanko, A., Heintz, D. Xenobiotics metabolization in Salix alba leaves uncovered by mass spectrometry imaging. Metabolomics. 15, 122 (2019).
- Khatib-Shahidi, S., Andersson, M., Herman, J. L., Gillespie, T. A., Caprioli, R. M. Direct Molecular Analysis of Whole-Body Animal Tissue Sections by Imaging MALDI Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 78 (18), 6448-6456 (2006).
