Mit optogenetischer Manipulation bestimmter neuronaler Populationen oder Hirnregionen kann das Verhalten bei frei beweglichen Tieren mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung verändert werden. Durch den Einsatz verschiedener optogenetischer Werkzeuge in Kombination mit chronisch implantierten optischen Fasern kann eine Vielzahl neuronaler Modulationen und Verhaltenstests durchgeführt werden.
Die optogenetische Modulation neuronaler Schaltkreise bei frei beweglichen Mäusen wirkt sich auf das akute und langfristige Verhalten aus. Diese Methode ist in der Lage, Manipulationen von einzelnen Neuronen und regionsspezifische Senderfreisetzung durchzuführen, bis hin zu ganzen neuronalen Schaltkreisen im zentralen Nervensystem, und ermöglicht die direkte Messung von Verhaltensergebnissen. Neuronen drücken optogenetische Werkzeuge über eine Injektion von viralen Vektoren aus, die die DNA der Wahl tragen, wie Channelrhodopsin2 (ChR2). Licht wird über chronische optische Implantate, die direkt über der Zielregion enden, in bestimmte Hirnregionen gebracht. Nach zwei Wochen Erholung und korrekter Werkzeugexpression können Mäuse wiederholt für Verhaltenstests mit optogenetischer Stimulation der Neuronen von Interesse verwendet werden.
Die optogenetische Modulation hat eine hohe zeitliche und räumliche Auflösung, die mit hoher Zellspezifität erreicht werden kann, im Vergleich zu den häufig verwendeten Methoden wie chemischer oder elektrischer Stimulation. Das Licht schadet dem neuronalen Gewebe nicht und kann daher sowohl für Langzeitexperimente als auch für mehrere Verhaltensexperimente mit einer Maus verwendet werden. Die Möglichkeiten optogenetischer Werkzeuge sind nahezu unbegrenzt und ermöglichen die Aktivierung oder das Stummschaltung ganzer Neuronen oder sogar die Manipulation eines bestimmten Rezeptortyps durch Licht.
Die Ergebnisse solcher Verhaltensexperimente mit integrierter optogenetischer Stimulation visualisieren Verhaltensänderungen, die durch die Manipulation verursacht werden. Das Verhalten desselben Tieres ohne Lichtstimulation als Basisistin ist eine gute Kontrolle für induzierte Veränderungen. Dies ermöglicht einen detaillierten Überblick über neuronale Typen oder Neurotransmitter-Systeme, die an bestimmten Verhaltensweisen beteiligt sind, wie Angst. Die Plastizität neuronaler Netzwerke kann auch durch Langzeitstimulation oder Verhaltensbeobachtungen nach optischer Stimulation sehr detailliert untersucht werden. Optogenetik wird helfen, neuronale Signalisierung bei verschiedenen Arten von neurologischen Erkrankungen zu erleuchten.
Die Modulation der neuronalen Schaltkreise im zentralen Nervensystem und ihre Verhaltensergebnisse sind wichtig für das Verständnis, wie das Gehirn funktioniert, vor allem bei psychiatrischen Erkrankungen und kognitiven Aufgaben wie Lernen und Gedächtnis. Mit der Optogenetik können einzellige zellen- oder Zellpopulationen bis hin zu ganzen Schaltkreisen durch Licht moduliert werden. Häufige optogenetische Werkzeuge wie Channelrhodopsin2 (ChR2) oder Archaerhodopsin (Arch) sind in der Lage, Neuronen zu aktivieren oder zum Schweigen zu bringen, oder die Freisetzung von Sendern an Axonklemmen zu erhöhen oder zu hemmen, die auf verschiedene Hirnregionen1,2,3,4projiziert werden. Arch muss jedoch sorgfältig verwendet werden, da gezeigt wurde, dass seine Aktivierung an präsynaptischen Klemmen die spontane Senderfreigabe5erhöht. Arch ist eine nach außen korrigierende Protonenpumpe, die den pH-Wert innerhalb der Zelle ändert. Dieses alkalische Milieu induziert Kalziumzufluss und verbessert die Senderfreisetzung5. Um spezifisch intrazelluläre Signalwege zu modulieren, können Rezeptorchimären, die aus einem lichtaktivierbaren optogenetischen Werkzeug wie Rhodopsin oder Kegelopsin bestehen, in Verbindung mit einem geeigneten G-Protein-gekoppelten Rezeptor6,,7,8erstellt werden. Die Menge und Variation der verfügbaren optogenetischen Werkzeuge hat in den letzten zehn Jahren deutlich zugenommen9.
Der Zweck der Optogenetik ist es, neuronale Schaltkreise während des Verhaltens zu manipulieren. Die Optogenetik ermöglicht beispielsweise die Messung akuter Verhaltensänderungen wie Veränderungen im Angstverhalten. Optogenetische Werkzeuge werden über virale Vektoren in Zielregionen des Gehirns geliefert. Mit Hilfe von speziellen Promotoren und Enhancern oder dem Cre-loxP-System kann die Zelltypspezifität für die Expression optogenetischer Werkzeuge gewährleistet werden (Abbildung 1A). Es gibt mehrere genetisch veränderte Mauslinien, die das Enzym Cre-Recombinase nur in bestimmten Zelltypen exemiten. Zum Beispiel drücken Nex-Cre-Mäuse die Cre-Recombinase in pyramidenförmigen Neuronen im Kortex und im Hippocampus unter der Kontrolle des Nex-Promotors10aus. Dieses Enzym ist in der Lage, DNA-Sequenzen umzukehren, die von loxP-Seiten11flankiert werden. Folglich kann die DNA-Sequenz eines doppelfläxten optogenetischen Werkzeugs, das von loxP-Seiten invertiert und flankiert wird, nur von Neuronen transkribiert werden, die die Cre-Recombinasebesitzen, aber nicht von anderen neuronalen Typen12,13. Bei Nex-Cre-Mäusen wird das optogenetische Werkzeug ausschließlich in pyramidenförmigen Neuronen ausgedrückt. Die Lichtstimulation bestimmter Hirnregionen erfolgt dann durch chronische Implantation von optischen Fasern direkt über dem Interessengebiet. Tiere können dann an eine geeignete Lichtquelle gekoppelt werden und verhalten sich in fast allen Arten von Verhaltenstests frei.
Abbildung 1: Injektion und Implantation. A) Cre-loxP-System für ChR2-YFP. Doppel-Floxed optogenetische nokgenetic Werkzeug wird in einem Adeno assoziierten Virus (AAV) für die Injektion in das Gehirngewebe verpackt. B) Sagittale Ansicht der Virusinjektion und Implantation einer optischen neuronalen Schnittstelle in/über dem IL-Bereich des mPFC. Injektion und Implantation wurden von oben durchgeführt. Alle Regionen von Interesse, IL, BLA und DRN, werden angezeigt. C) Detailansicht der implantierten optischen Faser, Hülse und Lichtquelle. D) Verbreitung der blauen und roten Laserlichtstimulation im grauen Materie-Hirngewebe aus einer 200-m-Lichtfaser (Yizhar et al. 2011). Blaues Licht breitet sich maximal 0,5 mm in das Gewebe aus, rotes Licht ca. 1 mm. Farbcodierung: rot 50%, gelb 10%, grün 5%, blau 1%, wenn Licht diesen Bereich erreicht. E) Koronale Ansicht der einseitigen Implantation direkt über der linken IL mit einer 200 m Glasfaser. Der IL-Bereich hat eine Breite von 0,25 mm in jeder Hemisphäre und eine Tiefe von 0,2 mm. Blaue und rote Glühbirnen sind die Boarder von 5% Licht ausbreitung und werden von Yizhar et al auf die richtige Größe übertragen. LoxP: Lokus von X-over P1; ChR2: Channelrhodopsin; YFP: gelbes fluoreszierendes Protein; dflox: doppelfloxiert; IL: infralimbischer Kortex; BLA: basolaterale Amygdala; DRN: dorsale raphe Kerne; PrL: prälimbische Region. Diese Zahl wurde von Berg 201948geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Optogenetische Ansätze werden genutzt, da sie sowohl eine hohe zeitliche als auch räumliche Auflösung14 und eine zelltypspezifische Modulation ermöglichen. Darüber hinaus ist es möglich, das implantierte Gerät ohne weitere Behandlung wiederholt zu verwenden. Nach einer stereotaktischen Operation, bei der die Injektion eines adenoassoziierten Virus, das das optogenetische Werkzeug trägt, und die Implantation der optischen Faser durchgeführt wird, können sich Mäuse zwei Wochen lang erholen. Wir haben eine Erholungszeit von nur 2 Wochen gewählt, weil dies genug Zeit ist, um sich von der Operation zu erholen und für das Virus auszudrücken. Da auf die Verhaltensexperimente die Immunhistochemie folgt, müssen wir sicherstellen, dass Mäuse während des Experiments nicht zu alt werden; andernfalls wird die Gewebequalität verringert. Sie zeigen keine offensichtlichen Verhaltensstörungen durch das Implantat und verhalten sich in einem typischen Käfigverhalten. Natürlich wird die Implantation von einer signifikanten chirurgischen Läsion begleitet; Daher werden die Mäuse intensiv überwacht. Nach der Operation müssen Mäuse einzeln untergebracht werden, da Gruppenmäuse dazu neigen, sich gegenseitig die frischen Wunden und Implantate zu verletzen. Jedoch, Gehäusebedingungen haben einen großen Einfluss auf die Angst ebene männlichen Mäusen, wie Einzelzimmer Mäuse zeigen niedrigere Angstniveaus15 und im Allgemeinen weniger depressiv-ähnliche Symptome16.
Chemische oder elektrische Manipulation von Gehirnschaltkreisen fehlt die hohe Zelltyp-Spezifität der Optogenetik und haben eine niedrigere zeitliche und räumliche Auflösung14,17,18. Je nach experimenteller Frage kann elektrische oder chemische Stimulation unterschiedliche Vorteile haben. Beim Passieren von Faserklemmen in einer bestimmten Region muss auch stimuliert werden, elektrische Stimulation ist die beste Methode. Chemische Stimulation ist eine gute Wahl, wenn senderspezifische Rezeptoren in einer ganzen Region von Agonisten aktiviert werden sollten. Ein weiterer großer Vorteil der Optogenetik im Vergleich zur chemischen oder elektrischen Stimulation ist, dass endogen, Neuronen sind nicht empfindlich auf Licht, die das Auftreten von Nebenwirkungen vermeidet19. In der Tat, hohe Lichtintensitäten können Heizeffekteinduzieren 8,20, aber aufgrund der richtigen Kontrollgruppen, die Verhaltenseffekte aufgrund optogenetischer Manipulation kann eliminiert werden.
Die Untersuchung des Nagetierverhaltens, insbesondere in Bezug auf psychiatrische Erkrankungen, hat sich mit der Optogenetik bei frei beweglichen Tieren erheblich verbessert, da es die direkte Modulation einzelner Rezeptoren bis zu bestimmten Zellpopulationen21 und Schaltkreise22ermöglicht. Die Möglichkeit, die akuten Wirkungen solcher Modulationen sowie die langfristigen Verhaltenseffekte nach einer definierten Zeit23 oder nach chronischer Stimulation24zu messen, ermöglicht eine breite Flexibilität experimenteller Entwürfe und bietet sehr detaillierte Einblicke in Gehirnschaltungen. Lichtstimulation kann verwendet werden, um Neuronen an der Injektionsstelle des optogenetischen Werkzeugs zu modulieren. Wenn sowohl die Injektion als auch die Implantation die gleiche Hirnregion ansprechen, können Zellkörper und rückenprojizierte Axone von Prinzipneuronen und Interneuronen in dieser Regionzielgerichtetwerden 3,6,8. Die Lichtfaser kann jedoch auch in einer anderen Region als der injizierten implantiert werden. In diesem Fall kann die Lichtstimulation die Senderentriegelung an Axonklemmen in Projektionsbereichen des injizierten Bereichs25,26,27modulieren.
In der Studie hier wird die Optogenetik in Kombination mit Experimenten zur Analyse von Angstverhalten eingesetzt. Angstbedingte psychiatrische Erkrankungen betreffen mehr als ein Drittel der Weltbevölkerung28,29,30 und verursachen eine hohe wirtschaftliche Belastung31. Betroffene leiden unter einem Gefühl von Erregung, Anspannung und Sorge, gefolgt von Vermeidungsverhalten32,33. Diese chronisch auftretenden negativen Emotionen, die sich hauptsächlich auf zukünftige Ereignisse konzentrieren34, stören stark den Alltag der Patienten. Häufige Behandlungen wie Benzodiazeze oder selektive Serotonin-Wiederaufnahmehemmer (SSRIs) sind nur bei einigen Patienten erfolgreich. Eine große Anzahl von Menschen reagieren überhaupt nicht auf die Behandlung35, was zeigt, dass der Mechanismus, der solchen Krankheiten zugrunde liegt, noch nicht vollständig verstanden ist. Der mediale präfrontale Kortex (mPFC) ist dafür bekannt, eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Manifestation von Angst21,25,27,36,37,38zu spielen. Insbesondere könnte die Überaktivierung der infralimbischen Kortex (IL) Region im mPFC Teil von Angststörungensein 39,40. Das hier beschriebene Beispielexperiment könnte helfen zu verstehen, wie Modulationen im IL-Bereich des mPFC das Angstverhalten beeinflussen. Darüber hinaus kann die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für angstbedingte psychiatrische Erkrankungen potenziell auch unterstützt werden.
2-6 Monate alte männliche Nex-Cre Mäuse werden verwendet, um ChR2 speziell in pyramidenförmigen Neuronen innerhalb der IL-Region des mPFC41auszudrücken. Nex-Cre-Mäuse haben einen C57Bl/6-Hintergrund und exprimieren das Enzym Cre-recombinase speziell in pyramidenförmigen Neuronen. Während einer stereotaktischen Operation wird die doppelfloxierte ChR2-DNA über adenoassoziierte virale Vektoren in die IL-Region injiziert. Das optische Implantat wird direkt über dem Interessenbereich platziert (Abbildung 1B) und das Implantat wird mit Zahnzement fixiert. Kontrolltiere erhalten eine Injektion von Doppel-Floxed-TdTomato-DNA in der gleichen Region, um zellspezifische Expression zu imitieren.
Die Tiere sind bis zum Tag der Operation in Gruppen untergebracht und danach einzeln untergebracht, um Verletzungen durch andere Mäuse zu vermeiden. Mäuse sind in einzelnen belüfteten Käfigen (IVC) in TypI-L Käfigen für Einzelmäuse untergebracht. Der Hell-Dunkel-Zyklus folgt einem 12:12 h-Rhythmus, die Lichtphase ab 10 Uhr. Alle Verhaltensexperimente werden in der dunklen Phase durchgeführt, die der aktiven Phase von Nagetieren ähnelt. Wasser und Standard-Lebensmittelpellets sind ad libitum erhältlich. Nach zwei Wochen der Genesung, die eine ausreichende Expression von ChR2 in pyramidenförmigen Neuronen gewährleistet, werden Mäuse für Verhaltensexperimente verwendet.
Das Open Field (OF) ist ein 50 cm x 50 cm quadratisches Labyrinth mit sandgestrahlten 40 cm hohen Wänden. Der Boden ist in 16 Quadrate unterteilt, wo die innere 4 das Zentrum darstellt. Das gemessene Verhalten ist: 1) Zeit in der Mitte verbracht, 2) Anzahl der Mitte Einträge, und 3) Gesamtentfernung verschoben. Während dieses Experiments gibt es 4 Versuche mit einer Gesamtzeit von 20 Minuten. In den Studien 1 und 3 findet keine Lichtstimulation statt, und in den Studien 2 und 4 wird eine 20 Hz Stimulation mit 5 ms Lichtimpuls und 1 mW Lichtintensität von 473 nm durchgeführt (Abbildung 2A). In den späteren Versuchen wurde die Gewöhnung an das Testgebiet berücksichtigt, aber die Verwendung von Schein-injizierten Kontrolltieren zeigt an, wie Gewöhnung ausgedrückt wird.
Das Barnes Maze ist ein Experiment für Lernen und Gedächtnis. Es ist eine kreisförmige Plattform mit einem Durchmesser von 92 cm und enthält 20 äquidistante Löcher um den Umfang. 19 der Löcher sind geschlossen und unter einem Loch wird ein Fluchtkasten präsentiert. An 4 aufeinanderfolgenden Tagen haben Mäuse 4 Trainingsversuche, um den Standort der Fluchtbox zu erfahren. Am5. Tag wird die Escapebox entfernt und Mäuse werden getestet, wie viel Zeit sie benötigen, um das richtige Loch zu finden. Das gemessene Verhalten ist: 1) Zeit, bis das Escape-Box/korrekte Loch gefunden wird, 2) Anzahl der Zielbesuche und Fehler und 3) Abstand verschoben, bis in das Escape-Box. Die Lichtstimulation in verschiedenen Gruppen erfolgt entweder während der Erfassung oder Konsolidierung, die an den Trainingstages 1-4 stattfinden, oder während des Abrufs am Testtag, d. h. Tag 5 (Abbildung 2D).
Abbildung 2: Verhaltensexperimente mit optogenetischen Protokollen. A) Schematische Zeichnung des Open Field-Experiments mit dem entsprechenden Lichtstimulationsprotokoll. C) Schematische Zeichnung des Elevated-Plus Maze-Experiments mit dem entsprechenden Lichtstimulationsprotokoll. D) Schematische Zeichnung des Barnes Maze-Experiments mit dem entsprechenden Lichtstimulationsprotokoll. EPM: Elevated-Plus Maze; VON: Open Field; BM: Barnes Maze Test. Diese Zahl wurde von Berg 201948geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Für die optogenetische Stimulation müssen Lichtintensität und -frequenz an das zu untersuchende optogenetische Werkzeug und den neuronalen Typ angepasst werden. Die geringstmögliche Lichtintensität sollte verwendet werden, um Schäden am Gewebe zu vermeiden, da mehrere Studien gezeigt haben, dass es mögliche Heizeffekte aufgrund der starken Lichtintensität8,20gibt. Für ChR2 wird häufig eine 20 Hz Stimulation mit einem 5 ms Lichtimpulsverwendet 2. Da ChR2 sehr lichtempfindlich ist, reichen 1 mW Lichtintensität aus. Das Lichtstimulationsprotokoll wechselt zwischen Licht aus und bei Versuchen, um Verhaltensänderungen direkt zu messen. Die äußeren Raumbedingungen für Verhaltensexperimente sollten für die gesamte Tiergruppe stabil bleiben. Wichtige Zu berücksichtigende Bedingungen sind das Rauschen (beachten Sie, dass Geräte selbst Geräusche machen können), der Geruch (immer die Verhaltenseinstellungen mit Ethanol reinigen), die Lichtintensität und der Experimentator. Der Experimentator sollte immer die gleiche Person sein. Darüber hinaus sollte die Tageszeit der Experimente für alle Tiere in einer Gruppe gleich sein, ein paar Stunden nach Beginn der dunklen Phase in der Anlage wird bevorzugt.
Das Ziel dieses Experiments ist es, das Anregungs-/Hemmungsverhältnis (E/I) in der IL-Region durch starke Aktivierung von erregenden pyramidenförmigen Neuronen zu erhöhen. Ein verbessertes E/I-Verhältnis in dieser speziellen Kortexregion ist bekannt, angstzuhaben bei Mäusen zu erhöhen40,42,43,44.
Die Verwendung von Licht zur Manipulation neuronaler Signalisierung ist seit fast einem Jahrzehnt die Methode der Wahl. Seit 2005 die Anzahl der veröffentlichten Artikel über die Entwicklung neuer optogenetischer Werkzeuge4,6,8,14,49,50,51 und Studien, in denen solche Werkzeuge verwendet werden, um Gehirn-Schaltungen zu untersuchen21,23,40,43,52, stark erhöht. Einerseits ist die Experimentiermöglichkeit mit der enormen Vielfalt an injizierbaren optogenetischen Werkzeugen, Implantationsvarianten, transgenen Mauslinien und Verhaltensexperimenten vielfältig und unbegrenzt. Andererseits ist die Möglichkeit, Fehler bei der Auswahl der Versuchsbedingungen zu machen, sehr hoch und die Experimente sind so spezifisch, dass oft die Vergleichbarkeit mit anderen Studien schwierig ist.
Kritische Schritte
Ein wichtiger wichtiger Schritt dieses Protokolls ist die ordnungsgemäße Planung. Die Wahl des optogenetischen Instruments sollte der wissenschaftlichen Frage entsprechen. Ist es nur notwendig, die Gesamtaktivität eines Neurons oder einer Synapse zu manipulieren? Dann sind kommerziell bereitgestellte Werkzeuge wie ChR221,25,27 und Arch37 eine gute Wahl. Aber abgesehen davon, wenn ein spezielles Neurotransmitter-System oder sogar ein einzelner Rezeptor manipuliert werden sollte, ist ein einzelner Rezeptor Chimäre oft die bessere Wahl3,6. Mehrere Rezeptor-Chimären mit GPCRs, die sogenannten Opto-XRs, und Richtlinien, um sie zu produzieren, sind bereits verfügbar4,50. Neben der Wahl optogenetischer Werkzeuge ist auch die Mauslinie in Kombination mit dem Verhaltensexperiment von entscheidender Bedeutung. Verschiedene Hintergrundstämme, wie z.B. C57Bl/6 und BALB/cByJ, zeigen in mancher Hinsicht unterschiedliche Verhaltensphänotypen53,54an. C57Bl/6-Mäuse haben eine niedrige Ausgangsangst und können für angstlösende Manipulationen verwendet werden, während BALB/cByJ höhere Angstniveaus aufweisen und daher empfindlicher auf angstlösende Medikamente reagieren. Darüber hinaus können die transgenen Varianten dieser Hintergrundstämme auch in ihrem Phänotyp48variieren. Mit einer richtigen Kombination spezifischer Promotoren in Verbindung mit einem optogenetischen Werkzeug und einer transgenen Mauslinie kann fast jede gewünschte Zellpopulation gezielt werden.
Ein kritischer Schritt während der Operation ist die Ausrichtung auf den richtigen Ort. Mit Hilfe des Maus-Gehirnatlas können die richtigen Koordinaten für die vordere-hintere Achse und die medial-laterale Achse und die Tiefe der Struktur45festgelegt werden. In Wirklichkeit hat jeder Schädel eine etwas andere Form und Größe. Daher ist der F-Faktor46 zur Einstellung der stereotaktischen Koordinaten sehr wichtig, ebenso wie die richtige Nasen- und Ohrfixierung während der stereotaktischen Chirurgie. Wenn der Kopf der Maus geneigt ist, wird die Injektionskanüle nicht auf den gewünschten Interessenbereich abzielen.
Darüber hinaus ist auch der Durchmesser der Injektionskanüle entscheidend. Wenn es zu klein ist, kann kein Virus in das Gewebe freigesetzt werden, wenn es zu breit ist, wird die Kanüle Viruslösung auf dem Weg in die Region von Interesse lecken. Wenn die implantierte optische Faser direkt über der Zielregion endet, spielt die Virusexpression in den oben genannten Kortexregionen keine Rolle. Wenn das Implantat jedoch über anderen Regionen platziert wird, um Axonklemmen zu stimulieren, werden die Axone der oberen Kortexregionen auch durch Licht aktiviert und verfälschen erhaltene Daten. Ein Beispiel: Die IL-Region und die prälimbische (PrL) Region projizieren beide auf die basale Amygdala55,56, haben aber völlig unterschiedliche Funktionen und Rollen in der Modulation von Angst26,57. Wenn das Implantat oberhalb der Amygdala platziert wird, um Axonklemmen aus der IL-Region zu aktivieren, und während der Injektionviruslösung auch in die PrL aufgrund der falschen Injektionskanüle gelegt wurde, ist das Risiko, auch Axonklemmen aus dem PrL zu aktivieren, sehr hoch.
Bei der Vorbereitung des Schädels auf die Fixierung des Implantats ist der spärliche Einsatz von Primer und Bindung entscheidend für eine zuverlässige und dauerhafte Fixierung. Wenn das 2-Komponenten-Haftsystem nicht dünn aufgetragen wird, kann sich der Zahnzement nach ein paar Tagen oder Wochen vom Schädel lösen. Darüber hinaus muss der Schädel auch vor der Fixierung des Implantats vollständig getrocknet werden, da sonst der Zement nicht richtig am Schädel befestigt wird.
Kritische Schritte sind auch im Verhaltensteil dieses Protokolls vorhanden. Erstens ist der Bau des Labyrinths sehr wichtig. In jedem Verhaltens-Setup existieren in der Literatur mehrere Varianten in Bezug auf Größe und Form, sowie für das Verfahren selbst58,59,60. Es ist wichtig, eine Variante zu wählen, die die Daten vergleichbar und reproduzierbar macht. Auch besondere Anforderungen an genutzte Mauslinien sollten berücksichtigt werden43,48. In den repräsentativen Daten für die EPM ist zu sehen, dass mehrere Nex-Cre-Mäuse aus dem Labyrinth fielen oder mehrmals abrutschten (Abbildung 2b). Für diese Mäuse wäre ein Labyrinth mit einer kleinen Wand um die offenen Arme eine bessere Alternative gewesen.
Zweitens ist es wichtig, alle äußeren Raumbedingungen konstant zu halten61, sonst wären verschiedene Gruppen von Mäusen überhaupt nicht vergleichbar. In dieser Hinsicht ist es sehr wichtig, die Zeit des Experiments als eine zu wählen, in der der Versuchsaufbau leer ist und der Experimentator immer anwesend ist. Darüber hinaus sollten Ereignisse im Gebäude, wie Bauarbeiten, Das Testen von Systemen (Feueralarm) oder der Reinigungstag der Mausanlage, berücksichtigt werden, um Störungen der erhaltenen Daten zu vermeiden.
Schließlich sind Handhabungs- und Gehäusebedingungen für Verhaltensexperimente von entscheidender Bedeutung. Wenn eine Implantation durchgeführt wird, müssen Mäuse allein untergebracht werden, da das Risiko einer Verletzung durch andere Mäuse besteht. Um eine gute Vergleichbarkeit zwischen Gruppen und einen niedrigen Fehler innerhalb einer Gruppe zu gewährleisten, muss jede Maus die gleiche Käfiggröße und -anreicherung aufweisen. Für Angst-bezogene Experimente, Einzelgehäuse hat einige Vorteile als singe untergebracht männliche Mäuse zeigen eine niedrigere Ausgangsangst Ebene, weniger Variation in ihrer Angst-Level, und weniger depressiv-ähnliche Symptome15,16. Gruppe untergebracht männliche Mäuse können in ihrer Angst Ebene aufgrund der Hierarchie unter den Mäusen stark unterscheiden. Neben dem Gehäuse ist auch ein konstanter und gleichberechtigter Umgang mit allen Mäusen und Gruppen wichtig. Die Maus zu greifen, um die Lichtfaser am Implantat zu verbinden, ist sehr anstrengend. Daher muss dieses Verfahren für jede Maus gleich sein, was die gleiche Technik und den gleichen Experimentator bedeutet. Darüber hinaus muss die Gewöhnungszeit im Wartekäfig, die die Maus von der stressigen Verbindungsprozedur abbringen soll, auch gleiche Bedingungen in Dauer, Wurf und Position zum Labyrinth haben. Die Handhabung innerhalb der Mausfunktion ist auch für die spätere Verhaltensleistung entscheidend. Versuchs- und Kontrolltiere sollten nicht an verschiedenen Tagen oder von verschiedenen Menschen gereinigt werden, da dies auch für Mäuse belastend ist. Darüber hinaus sollte der Reinigungstag nicht der versuchsweise Tag sein, um Verhaltensunterschiede zu vermeiden.
Problembehandlung
Es gibt mehrere Probleme, die während des Protokolls auftreten können. Zum Beispiel könnte das Bohren eines Ganzen im Schädel während der stereotaktischen Operation Blutgefäße schädigen. In der Regel tritt starke Blutungen auf, vor allem über Bregma und Lambda. Wenn dies geschieht, versuchen Sie nicht, die Blutung mit Baumwollstäben zu stoppen, da sie dazu neigen, noch mehr Blutungen aus dem Gefäß wegen ihrer Saugfähigkeit zu verlängern, sondern direkt mit NaCl abspülen.
Es kann auch vorkommen, dass die Druckinjektion der Viruslösung nicht funktioniert. In diesem Fall könnte es sein, dass Parafilm, ein Schorf aus dem Gratloch oder Hirngewebe, die Spitze der Kanüle verstopft. Entfernen Sie in diesem Fall die Kanüle langsam aus dem Gehirn, ohne die x- oder y-Achse zu ändern, und entfernen Sie mit einer Pinzette 1-2 mm des vorderen Teils der Kanülenspitze. Bevor Sie die Kanüle erneut senken, testen Sie die Funktionalität, indem Sie einen kleinen Druck ausüben, um zu sehen, ob das Virus aus der Kanülenspitze kommt. Um Verstopfung zu vermeiden, senken Sie die Kanüle mit einer konstanten Geschwindigkeit und stoppen Sie die Bewegung nicht, bis die tiefste Tiefe der Injektionsseite erreicht ist. Wenn zu viel der Kanülenspitze entfernt wird und der Durchmesser zu groß ist, wird die Kanüle Gewebe schädigen und das Risiko, das Virus auf einmal anzuwenden, erhöht. Stellen Sie daher sicher, dass nur der verstopfte Teil der Spitze sorgfältig entfernt wird.
Während des Verhaltensexperiments kann die Einrichtung des Experiments in der Video-Tracking-Software (z. B. Ethovision XT) Probleme verursachen. Wenn z. B. die Lichtleistung nicht richtig funktioniert, kann dies aus mehreren Gründen geschehen. Der Pulser muss geöffnet, programmiert und gestartet werden, bevor Ethovision XT geöffnet wird. Die Hardware muss im “Experimentellen Setup” (Schritt 3.2.2.4) korrekt ausgewählt werden. Wenn die falsche IO-Box oder etwas anderes als “Costume Hardware” ausgewählt ist, kann das Pulser-Gerät nicht von Ethovision gesteuert werden. Wenn der Test der Lichtleistung erfolgreich ist, aber das programmierte Lichtprotokoll in “Teststeuerungseinstellungen” während der Erfassung nicht funktioniert, kann die Unterregel oder Unterregelreferenz falsch lokalisiert werden oder die Bedingungen und Aktionen sind unklar. Zum Beispiel: Gehört der Verweis zur richtigen Unterregel? Ist die Referenz korrekt programmiert (z.B. wie oft wird die Unterregel ausgeführt)?
Darüber hinaus kann es vorkommen, dass das Tier während der “Erkennungseinstellungen” angemessen verfolgt wird, aber während der Erfassung gibt es Proben, bei denen das Motiv nicht gefunden wird. Überprüfen Sie in diesem Fall, ob die Beleuchtung im Versuchsraum verändert wurde oder ob irgendetwas unerwünschte Schatten im Labyrinth erzeugt. Der gesamte Boden des Labyrinths muss die gleiche Farbe haben, da die Einstellung nur für eine bestimmte Kombination funktioniert. Wenn aus welchen Gründen auch immer unterschiedliche Unterfarben oder Schatten nicht vermieden werden können, definieren Sie die Erkennungseinstellung im dunkelsten Teil des Labyrinths.
Um Einstellungen nach dem Erwerb der ersten Tiere zu ändern, wenden Sie diese Änderungen nicht in den bereits verwendeten Einstellungen an. Duplizieren Sie sie, um sie anzupassen. Dies bedeutet auch, dass die bereits aufgezeichnete Studie für die Datenanalyse nicht mehr gültig ist. Zeichnen Sie in einem solchen Fall alle Tiere für diese Versuchsgruppe mit den ursprünglichen Einstellungen auf und erstellen Sie anschließend ein neues Experiment, bei dem die aufgenommenen Videos anstelle von Live-Tracking analysiert werden. In diesem “von Video”-Experiment können mehrere Einstellungen für die Analyse verwendet werden, ohne die Vergleichbarkeit zwischen Tieren oder sogar Daten zu verlieren.
Einschränkungen und zukünftige Anwendungen
Diese Methode der Manipulation des Verhaltens mit der Optogenetik bei frei beweglichen Tieren beinhaltet auch Einschränkungen. Während der Operation ist die Nähe der beiden Implantate eingeschränkt. Bei der doppelten Implantation muss der Abstand zwischen den beiden Implantaten minimal die Breite des Geräts sein, um das Implantat zu halten. Das Gerät muss das zweite Implantat in das Gratloch senken, während die ersten Implantate bereits fixiert sind. Eine Lösung dafür könnte eine abgewinkelte Implantation sein, bei der die Spitzen der Glasfaser sehr nah sein können, während die Keramikfeder über dem Schädel einen größeren Abstand23,55,,56,57,62,63haben. Ein Nachteil einer abgewinkelten Implantation ist die Lichtausbreitung. Wenn die Faserspitze schräg statt von geradeoben ist, ist der stimulierte Bereich anders. Bei zwei Zielregionen in unmittelbarer Nähe muss die veränderte Position der Lichtstimulation berücksichtigt werden.
Während des Verhaltensexperiments kann die Konstruktion des Labyrinths das mit dem Tier verbundene optische Kabel stören. Einige Verhaltenstests, wie z. B. die Hell-Dunkel-Box, enthalten einen Innenbereich64,65, und andere Labyrinthe enthalten Fächer, die die Maus betreten muss. Solche Experimente können mit diesem Setup nicht durchgeführt werden. Alternativ kann ein drahtloses System eine Option22,26,66sein. Aber zum Glück können einige Labyrinthe, wie das Barnes Maze, so angeordnet werden, dass die Mäuse die entsprechenden Fächer67betreten können.
Neben solchen mit geschlossenen Zonen können auch zu breite Labyrinthe Probleme verursachen. Je größer die Fläche des Labyrinths, desto länger muss das Kabel sein, damit das Tier an jede Position im Labyrinth gehen kann. Es ist darauf zu achten, dass das Tier nicht in der Lage ist, auf das Kabel zu treten oder es zu greifen und es zu beißen. Eine Lösung dafür könnte eine Konstruktion sein, die das redundante Kabel aufrollt. Ein Nachteil ist, dass der Luftwiderstand zum Ausrollen des Kabels für Mäuse schwierig ist. Diese Lösung würde besser für Ratten geeignet. Eine weitere Möglichkeit könnte sein, die Lichtstimulation im Voraus durchzuführen, statt während des Experiments ist dies natürlich nur möglich, wenn ein Langzeiteffekt durch die Lichtstimulation auftritt23.
Vergleich zu bestehenden/alternativen Methoden
Alternative Methoden wären chemische oder elektrische Stimulation während des Verhaltens8,18. Chemische Agonisten oder Antagonisten sind in der Lage, Neuronen über bestimmte Rezeptoren zu aktivieren oder zum Schweigen zu bringen und können auch einzelne Neurotransmitter-Systeme38,68manipulieren. Einerseits ist die Rezeptor-Spezifität für Chemikalien recht hoch, da spezifischer Agonist oder Antagonist nur bestimmte Rezeptoren aktiviert39. Auf der anderen Seite, die Spezifität für Rezeptor-Subtypen der gleichen Neurotransmitter-Gruppe ist oft unzureichend. Die meisten Chemikalien binden an mindestens zwei Untertypen mit unterschiedlichen Wahrscheinlichkeiten69. Darüber hinaus können Chemikalien nicht zwischen neuronalen Zelltypen unterscheiden, solange sie die gleichen Rezeptortypen besitzen. Darüber hinaus ist die zeitliche und räumliche Auflösung schlecht für chemische Manipulationen im Vergleich zur Optogenetik. Agonisten oder Antagonisten werden oft oral35 oder über systemische Injektionen57,70verabreicht. Wenn die Infusion der Chemikalie direkt im Gehirngewebe erfolgt, effekte schneller als bei oralen Anwendungen, aber immer noch auf einer langsameren Zeitskala als bei der Lichtstimulation. Da die verabreichten Chemikalien im Gehirn diffundieren und nicht spezifisch für neuronale Typen oder Hirnregionen sind, ist die Manipulation bestimmter Gehirnschaltkreise nicht möglich.
Elektrische Stimulation hat eine höhere zeitliche Auflösung als chemische Stimulation9,14. Die Streuung im neuronalen Gewebe ist geringer als bei der chemischen Stimulation und die räumliche Auflösung ist besser als bei der chemischen Stimulation. Die elektrische Stimulation hat jedoch keine Möglichkeit, verschiedene neuronale Zelltypen oder Rezeptortypen gezielt anzusprechen, da jedes Neuron in der Nähe der Elektrode auf die elektrische Stimulation reagiert.
Alternative Methoden zum Verhalten bei frei beweglichen Mäusen sind beispielsweise elektrophysiologische Aufnahmen in Hirnscheiben, bei denen einzelne Neuronen oder Axone mit Optogenetik moduliert und Effekte über die Aufzeichnung von Elektroden6,71gemessen werden können. In-vitro-Experimente bieten die Möglichkeit, die molekulare und zelluläre Basis optogenetischer Stimulationen zu untersuchen, haben aber die Einschränkung, dass intrinsische Konnektivität und Input aus anderen Hirnregionen fehlen. Eine weitere Möglichkeit ist die Optogenetik in Verbindung mit Multiphotonen-Bildgebung1,72. In diesem Fall haben Mäuse ihren Kopf fixiert und können beästhetisiert werden oder wach sein, um einfache Aufgaben zu lösen.
Um ein erfolgreiches optogenetisches Experiment durchzuführen, stehen heutzutage eine breite Palette von Werkzeugen und Anwendungen zur Verfügung. Die Auswahl optogenetischer Werkzeuge und die Verhaltenseinstellung sind entscheidend, um spezifische Forschungsfragen zu beantworten. Wenn die richtige Kombination von Werkzeugen und Experimenten gewählt wird, ermöglicht die Optogenetik eine beispiellose, eingehende Untersuchung neuronaler Schaltkreise mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung. Dies wird dazu beitragen, neue therapeutische Strategien für psychiatrische Erkrankungen und Kognition zu verstehen und zu entwickeln.
The authors have nothing to disclose.
Herzlichen Dank an Prof. Klaus-Armin Narve und Dr. Sandra Goebbels (Max-Plank-Institut für Experimentelle Medizin, Göttingen, Deutschland) für die freundliche Bereitstellung von Nex-Cre-Mäusen. Außerdem danken wir unserem Video-Team Yunus Dikici und Ruben Wiesner für die Aufnahme und Bearbeitung des JoVE-Videos für diesen Artikel. Außerdem vielen Dank an Kristin Claussen für ihre Stimme und Kimberly Anne Go für das Korrekturlesen des Manuskripts.
Die vorgestellten Ergebnisse wurden an der Ruhr-Universität Bochum eingeholt und das Video an der Universität Bremen aufgenommen.
Gefördert wurde diese Arbeit von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) – Projektnummer 122679504 – SFB 874 und DFG MA 4692/3-2.
Ketamin | Sigma-Aldrich | K2753-64 | Anestasia |
20 % Glucose | AlleMan Pharma | Injection s.c. for fast recovery | |
Behavioral mazes | Costum made | Measure anxiety | |
Bepanthen | Bayer | Ophthalmic oinment | |
Betaisodona | Monodipharma | Sterilant containing iodine | |
Betaisodona | Monodipharma | Iodine oinment | |
Binocular | Olympus | SZ52, 110AL0.62x WD160 | Surgery |
Ceramic ferrules | Thorlabs | CFLC230-10 | Implant |
Ceramic Fiber Scribe | Thorlabs | CSW12.5 | Cutting of the glass fiber |
Channelrhodopsin2-YFP virus | Penn Vector Core | Addgene 20298 | Optogenetic tool |
Compressed air | Kontakt Chemie | Druckluft 67 | Drying of the skull |
Coordinate system | Stoelting | Stereotactic coordinates for the surgery | |
Correl Draw | Graphical software version 13 | ||
Cryoslicer | MICROM | HM500OM | Production of brain slices for staining |
Ethovision XT 14 | Noldus | Software for behavioral tracking | |
Exel | Statistical Software | ||
Ferrule Polishing Puck | Thorlabs | D50-F | Polishing implants round side |
Fiber Patch Cord dual | Prizmatix | Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm | Cables, which are connected with the two implants of a bilateral implantation |
Fiber Patch Cord single | Prizmatix | Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm | Cable, which is connected with the implant via a sleeve |
Fiber Stripping Tool | Thorlabs | T06S13 | Stripping glass fiber for implant |
Filter paper | VWR European | 516-0300 | Cut into pieces for the Novelty-Suppressed Feeding test |
Food pellets | Mühle Levers | Höveler Nagerfutter | Nutrition for the mice |
Glass pipettes | Harvard Apparatus | GC150-10 | Injection pipettes |
Gradia direct-Flo | Henry Schein | 103322 | Fluid dental cementum |
Heating lamp | efbe-Schott/Phillips | R95E | Prevent the mice from cooling after the surgery |
Heating plate | Stoelting | Integrated into coordinate system | |
Injection canula | Braun | 100 Sterican, 0,4 x 20 mm, Gr. 20 | All injections and to bore hole into the skull |
Litter | T 1350 | Grounding for the Novelty-Supressed Feeding test | |
Mouse cages | Zoonlab | 405 cm^2 | Single housing for experiments |
Optibond FL | Kerr | 26684E | Preparation of the skull for implantation |
Optical glass fiber | Thorlabs | FT200EMT | Light fiber for implant |
Optogenetics-LED.STSI | Prizmatix | Optogenetic toolbox for light stimulation during behavioral experiments | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005-1KG-R | Perfusion of mice to remove the brains |
Polishing sheet 0.02 µm grit | Thorlabs | LFCF | Polishing implants round side |
Polishing sheet 1 µm grit | Thorlabs | LF1D | Polishing implants round side |
Polishing sheet 30 µm grit | Thorlabs | LF30D | Polishing implants round side |
Polishing sheet 6 µm grit | Thorlabs | LF6D | Polishing implants round side |
Pulser Software | Prizmatix | Software for light device control | |
Rimadyl-Carprofen | Zoetis | Analgesia | |
Sigma Plot | Software for statistics | ||
Sleeve | Thorlabs | FT200EMT | Connection of implant and light cable |
SodiumCloride (NaCl) | Braun | 3570410 | Rinsing of the skull |
Superglue | Pattex Henkel | To Fix the glass fiber in the ferrule | |
td-Tomato virus | Penn Vector Core | Addgene 51503 | Optogenetic tool |
UV light | KoQGHJ | wireless, 1200 mW/cm^2 | Polymeration lamp for dental cementum |
Xylavet-Xylazin | cp pharma | Anesthesia |