In Situ Chemotaxis Assay to Examine Microbial Behavior in Aquatic Ecosystems
Summary
Hier gepresenteerd is het protocol voor een in situ chemotaxis test, een recent ontwikkeld microfluïdisch apparaat dat studies van microbiële gedrag direct in de omgeving mogelijk maakt.
Abstract
Microbiële gedragingen, zoals beweeglijkheid en chemotaxi’s (het vermogen van een cel om de beweging te veranderen in reactie op een chemische gradiënt), zijn wijdverspreid over de bacteriële en archaeale domeinen. Chemotaxis kan resulteren in aanzienlijke voordelen voor het verkrijgen van hulpbronnen in heterogene omgevingen. Het speelt ook een cruciale rol in symbiotische interacties, ziekte, en mondiale processen, zoals biogeochemische fietsen. De huidige technieken beperken het chemotaxis-onderzoek echter tot het laboratorium en zijn niet gemakkelijk toepasbaar in het veld. Hier gepresenteerd is een stap-voor-stap protocol voor de inzet van de in situ chemotaxis test (ISCA), een apparaat dat robuuste ondervraging van microbiële chemotaxi’s direct in de natuurlijke omgeving mogelijk maakt. De ISCA is een microfluïdisch apparaat bestaande uit een 20 put array, waarin chemische stoffen van belang kunnen worden geladen. Eenmaal ingezet in waterige omgevingen verspreiden chemicaliën zich uit de putten, waardoor concentratiegradiënten ontstaan die microben voelen en erop reageren door via chemotaxi’s in de putten te zwemmen. De putinhoud kan vervolgens worden bemonsterd en gebruikt om (1) de sterkte van de chemotactische reacties op specifieke verbindingen te kwantificeren door middel van stroomcytometrie, (2) isolaat en cultuur responsieve micro-organismen, en (3) karakteriseren de identiteit en genomische potentieel van de reagerende populaties door middel van moleculaire technieken. De ISCA is een flexibel platform dat kan worden ingezet in elk systeem met een waterige fase, inclusief mariene, zoetwater- en bodemomgevingen.
Introduction
Diverse micro-organismen gebruiken beweeglijkheid en chemotaxi’s om fragmentarische voedingsomgevingen te benutten, hosts te vinden of schadelijke aandoeningen te vermijden1,,2,,3. Deze microbiële gedragingen kunnen op hun beurt de tarieven van chemische transformatiebeïnvloeden 4 en symbiotische partnerschappen bevorderen in terrestrische, zoetwater- en mariene ecosystemen2,5.
Chemotaxis is uitgebreid onderzocht onder laboratoriumomstandigheden voor de afgelopen 60 jaar6. De eerste kwantitatieve methode om chemotaxi’s te bestuderen, de capillaire test, omvat een capillaire buis gevuld met een vermeende chemoattractant ondergedompeld in een suspensie van bacteriën6. Diffusie van de chemische stof uit de buis creëert een chemische gradiënt, en chemotactische bacteriën reageren op dit gradiënt door te migreren naar de buis7. Sinds de ontwikkeling van de capillaire test, die vandaag de dag nog steeds veel wordt gebruikt, zijn er veel andere technieken ontwikkeld om chemotaxi’s te bestuderen onder steeds gecontroleerdere fysische/chemische omstandigheden, waarbij de meest recente waarbij microfluidics8,9,10betrokken zijn .
Microfluidics, samen met high-speed video microscopie, maakt het bijhouden van het gedrag van enkele cellen in reactie op zorgvuldig gecontroleerde gradiënten. Hoewel deze technieken ons begrip van chemotaxi’s enorm hebben verbeterd, zijn ze beperkt tot laboratoriumgebruik en vertalen ze zich niet gemakkelijk naar veldinzet in milieusystemen. Als gevolg daarvan is het vermogen van natuurlijke gemeenschappen van bacteriën om chemotaxi’s te gebruiken binnen natuurlijke ecosystemen niet onderzocht; dus, het huidige begrip van het potentiële ecologische belang van chemotaxis is bevooroordeeld in de richting van kunstmatige laboratoriumomstandigheden en een beperkt aantal laboratorium-gekweekte bacteriële isolaten. De recent ontwikkelde ISCA overwint deze beperkingen11.
De ISCA bouwt voort op het algemene principe van de capillaire test; het maakt echter gebruik van moderne microfabricagetechnieken om een zeer gerepliceerd, gemakkelijk inzetbaar experimenteel platform te leveren voor de kwantificering van chemotaxi’s naar verbindingen van belang in de natuurlijke omgeving. Het maakt ook identificatie en karakterisering van chemotactische micro-organismen door directe isolatie of moleculaire technieken. Terwijl het eerste werkende apparaat zelf vervaardigd en gebouwd van glas en PDMS11was, is de nieuwste spuitgegoten versie samengesteld uit polycarbonaat, met behulp van een sterk gestandaardiseerde fabricageprocedure (voor interesse in de nieuwste versie van het apparaat, kunnen de overeenkomstige auteurs gecontacteerd worden).
De ISCA is credit card-sized en bestaat uit 20 putten verdeeld in een 5 x 4 put array, elk gekoppeld aan de externe aquatische omgeving door een kleine haven (800 μm in diameter; Figuur 1). Putatieve chemoattractants geladen in de putten verspreiden zich in de omgeving via de haven, en chemotactische microben reageren door te zwemmen via de haven in de put. Aangezien veel factoren de uitkomst van een ISCA-experiment in de natuurlijke omgeving kunnen beïnvloeden, zal dit stapsgewijze protocol nieuwe gebruikers helpen potentiële obstakels te overwinnen en effectieve implementaties te vergemakkelijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Op de schaal van aquatische micro-organismen is het milieu verre van homogeen en wordt het vaak gekenmerkt door fysische/chemische gradiënten die microbiële gemeenschappenstructureren 1,15. De capaciteit van motile micro-organismen om gedrag te gebruiken (d.w.z. chemotaxis) vergemakkelijkt het foerageren binnen deze heterogene micro-omgevingen1. Het direct in het milieu bestuderen van chemotaxi’s heeft het potentieel om belangrijke inter…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd mede gefinancierd door het Gordon and Betty Moore Foundation Marine Microbiology Initiative, via subsidie GBMF3801 aan J.R.S. en R.S., en een Investigator Award (GBMF3783) aan R.S., evenals een Australian Research Council Fellowship (DE160100636) aan J.B.R., een prijs van de Simons Foundation aan B.S.L. (594111), en een subsidie van de Simons Foundation (542395) aan R.S. als onderdeel van de Principles of Microbial Ecosystems (PriME) Collaborative.
Materials
| Acrylic glue | Evonik | 1133 | Acrifix 1S 0116 |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8505K725 | Or different company |
| Adhesive tape | Scotch | 3M 810 | Scotch Magic tape |
| Autoclave | Systec | D-200 | Or different company |
| Benchtop centrifuge | Fisher Scientific | 75002451 | Or different company |
| Bungee cord | Paracord Planet | 667569184000 | Or different company |
| Centrifuge tube – 2 mL | Sigma Aldrich | BR780546-500EA | Eppendorf tube |
| Conical centrifuge tube – 15 mL | Fisher Scientific | 11507411 | Falcon tube |
| Conical centrifuge tube – 50 mL | Fisher Scientific | 10788561 | Falcon tube |
| Deployment arm | Irwin | 1964719 | Or different company |
| Deployment enclosure plug | Fisher Scientific | 21-236-4 | See alternatives in manuscript |
| Disposable wipers | Kimtech – Fisher Scientific | 06-666 | Kimwipes |
| Flow cytometer | Beckman | C09756 | CYTOFlex |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma Aldrich | G5882 | Or different company |
| Green fluorescent dye | Sigma Aldrich | S9430 | SYBR Green I – 1:10,000 final dilution |
| Hydrophilic GP filter cartridge – 0.2 µm | Merck | C3235 | Sterivex filter |
| In Situ Chemotaxis Assay (ISCA) | – | – | Contact corresponding authors |
| Laser cutter | Epilog Laser | Fusion pro 32 | Or different company |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Or different company |
| Marine Broth 2216 | VWR | 90004-006 | Difco |
| Nylon slotted flat head screws | McMaster-Carr | 92929A243 | M 2 × 4 × 8 mm |
| Pipette set | Fisher Scientific | 05-403-151 | Or different company |
| Pipette tips – 1 mL | Fisher Scientific | 21-236-2A | Or different company |
| Pipette tips – 20 µL | Fisher Scientific | 21-236-4 | Or different company |
| Pipette tips – 200 µL | Fisher Scientific | 21-236-1 | Or different company |
| Sea salt | Sigma Aldrich | S9883 | For artificial seawater |
| Serological pipette – 50 mL | Sigma Aldrich | SIAL1490-100EA | Or different company |
| Syringe filter – 0.02 µm | Whatman | WHA68091002 | Anatop filter |
| Syringe filter – 0.2 µm | Fisher Scientific | 10695211 | Or different company |
| Syringe needle 27G | Henke Sass Wolf | 4710004020 | 0.4 × 12 mm |
| Syringes – 1 mL | Codau | 329650 | Insulin Luer U-100 |
| Syringes – 10 mL | BD | 303134 | Or different company |
| Syringes – 50 mL | BD | 15899152 | Or different company |
| Tube rack – 15 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Tube rack – 50 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap | McMaster-Carr | 8305A77 | Or different company |
| Vacuum filter – 0.2 µm | Merck | SCGPS05RE | Steritop filter |
References
- Stocker, R. Marine microbes see a sea of gradients. Science. 338, 628-633 (2012).
- Raina, J. B., Fernandez, V., Lambert, B., Stocker, R., Seymour, J. R. The role of microbial motility and chemotaxis in symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 17, 284-294 (2019).
- Chet, I., Asketh, P., Mitchell, R. Repulsion of bacteria from marine surfaces. Applied Microbiology. 30, 1043-1045 (1975).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. PNAS. 113, 1576-1581 (2016).
- Matilla, M., Krell, T. The effect of bacterial chemotaxis on host infection and pathogenicity. FEMS Microbiology Reviews. 42, (2018).
- Adler, J. Chemotaxis in bacteria. Science. 153, 708-716 (1966).
- Adler, J., Dahl, M. M. A method for measuring the motility of bacteria and for comparing random and non-random motility. Journal of General Microbiology. 46, 161-173 (1967).
- Ahmed, T., Shimizu, T. S., Stocker, R. Microfluidics for bacterial chemotaxis. Integrative Biology. 2, 604-629 (2010).
- Hol, F. J. H., Dekker, C. Zooming in to see the bigger picture: microfluidic and nanofabrication tools to study bacteria. Science. 346, 1251821 (2014).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology. Annual Review of Biophysics. 43, 65-91 (2014).
- Lambert, B. S., et al. A microfluidics-based in situ chemotaxis assay to study the behaviour of aquatic microbial communities. Nature Microbiology. 2, 1344-1349 (2017).
- Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I. Applied Environmental Microbiology. 63, 186-193 (1997).
- Rinke, C., et al. Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics. Nature Protocols. 9, 1038-1048 (2014).
- Gaworzewska, E. T., Carlile, M. J. Positive chemotaxis of Rhizobium leguminosarum and other bacteria towards root exudates from legumes and other plants. Microbiology. , (1982).
- Walker, T. S., Bais, H. P., Grotewold, E., Vivanco, J. M. Root exudation and rhizosphere biology. Plant Physiology. 132, 44-51 (2003).
