수생 생태계에서 미생물 행동을 검사하는 시투 화학 분석분석
Summary
여기에 제시된 것은 환경에서 직접 미생물 행동의 연구를 가능하게 하는 최근 개발된 미세 유체 장치인 시투 화학분석분석의 프로토콜이다.
Abstract
운동성 및 화학 요법과 같은 미생물 행동 (화학 적 그라데이션에 대한 응답으로 움직임을 변경하는 세포의 능력)은 세균 및 고고학 도메인에 걸쳐 널리 퍼져 있습니다. 화학 요법은 이기종 환경에서 상당한 자원 획득 이점을 초래할 수 있습니다. 또한 생지구화학적 사이클링과 같은 공생 상호 작용, 질병 및 글로벌 프로세스에서 중요한 역할을 합니다. 그러나, 현재 기술은 실험실에 화학 요법 연구를 제한하고 필드에 쉽게 적용되지 않습니다. 여기에 제시된 현장 화학 요법 분석(ISCA)의 배치를 위한 단계별 프로토콜이며, 이는 자연 환경에서 직접 미생물 화학요법의 강력한 심문을 가능하게 하는 장치이다. ISCA는 관심 있는 화학물질을 적재할 수 있는 20개의 웰 어레이로 구성된 미세 유체 장치입니다. 일단 수성 환경에 배치되면, 화학 물질은 우물밖으로 확산되어 미생물이 화학 요법을 통해 우물로 수영하여 감지하고 반응하는 농도 그라데이션을 만듭니다. 상기 웰 함량은 유동 세포측정을 통해 특정 화합물에 대한 화학 반응의 강도를 정량화하고, (2) 분리 및 배양 반응성 미생물을 정량화하고, (3) 분자 기술을 통해 반응하는 집단의 정체성과 게놈 잠재력을 특성화하는 데 사용될 수 있다. ISCA는 해양, 담수 및 토양 환경을 포함하여 수성 단계를 갖춘 모든 시스템에 배포할 수 있는 유연한 플랫폼입니다.
Introduction
다양한 미생물은 연골과 화학요법을 사용하여 영양 환경을 이용하거나, 호스트를 찾거나, 해로운 조건1,,2,,3을피한다. 이러한 미생물 행동은 차례로 화학 적변형의 비율에 영향을 미칠 수 있습니다 4 지상파, 담수, 해양 생태계에 걸쳐 공생 파트너십을 촉진2,,5.
화학 요법은 지난 60 년 동안 실험실 조건에서 광범위하게 연구되었습니다6. 화학을 연구하는 첫번째 정량적인 방법, 모세관 분석, 박테리아 6의 현탁액에 침지된 putative 화학요법제로 채워진 모세관관을 관련시킵니다6. 튜브 에서 화학 물질의 확산은 화학 적 그라데이션을 생성하고, 화학 박테리아는 튜브로 이동하여이 그라데이션에 반응7. 모세관 분석의 개발 이후, 오늘날에도 널리 사용되고 있는 다른 많은 기술은 점점 더 통제되는 물리적/화학적 조건 하에서 화학요법을 연구하기 위해 개발되었으며, 가장 최근에는 미세유체제 의 사용과 관련된8,,9,,10.
미세 유체는 고속 비디오 현미경 검사법과 함께 신중하게 제어된 그라데이션에 대응하여 단일 세포의 동작을 추적할 수 있습니다. 이러한 기술은 화학 요법에 대한 우리의 이해를 크게 향상했지만 실험실 사용으로 제한되었으며 환경 시스템의 현장 배치로 쉽게 변환되지 않습니다. 결과적으로, 자연 생태계 내에서 화학 요법을 사용 하 여 박테리아의 자연 커뮤니티의 용량 검사 되지 않았습니다.; 따라서, 화학 요법의 잠재적 인 생태학적 중요성의 현재 이해는 인공 실험실 조건과 실험실 배양 세균 분리의 제한된 수에 편향된다. 최근 개발 된 ISCA는 이러한 한계를 극복11.
ISCA는 모세관 분석의 일반적인 원리를 기반으로 합니다. 그러나 현대 의 미세 제조 기술을 사용하여 자연 환경에 대한 관심 화합물에 대한 화학 요법의 정량화를 위해 매우 복제되고 쉽게 배포 할 수있는 실험 플랫폼을 제공합니다. 또한 직접적인 격리 또는 분자 기술에 의한 화학적 미생물의 식별 및 특성화를 허용합니다. 첫 번째 작업 장치는 유리 및PDMS(11)로자체 제작 및 제작되었지만, 최신 사출 성형 버전은 고도로 표준화된 제조 절차를 사용하여 폴리카보네이트로 구성됩니다(최신 버전의 장치에 대한 관심으로 해당 작성자는 연락할 수 있음).
ISCA는 신용 카드 크기이며 5 x 4 웰 어레이에 분포된 20개의 우물로 구성되어 있으며, 각 우물은 작은 포트(직경 800 μm)에 의해 외부 수생 환경에 연결됩니다. 그림 1). 우물에 적재된 처제 화학물질은 항구를 통해 환경으로 확산되고, 항만을 통해 우물로 수영하여 화학물질 미생물이 반응한다. 자연 환경에서 ISCA 실험의 결과에 영향을 줄 수 있는 많은 요인이 발생할 수 있는 이 단계별 프로토콜은 새로운 사용자가 잠재적인 장애물을 극복하고 효과적인 배포를 용이하게 하는 데 도움이 됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
수생 미생물의 규모에서, 환경은 균질과는 거리가 멀며 종종 미생물 공동체1,15를구성하는1물리적/ 화학적 그라데이션을 특징으로 한다. 모틸성 미생물의 용량은 거동(즉, 화학요법)을 사용하여 이러한 이질적인 미생물 환경1내에서 포징을 용이하게 한다. 환경에서 직접 화학 요법을 연구하는 것은 중요한 상호 작용 및 화학 적 선호도?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 고든과 베티 무어 재단 해양 미생물학 이니셔티브에 의해 부분적으로 투자되었다, J.R.S.와 R.S.에 GBMF3801을 부여를 통해, 그리고 조사자 상 (GBMF3783) R.S.에, 뿐만 아니라 J.B.R.에 호주 연구 위원회 펠로우십 (DE160100636), B.S.L. (594111)에 시몬스 재단에서 상, 사이먼스 재단 (542395)에서 R.S.에 대한 보조금 (프리메) 협력의 일환으로.
Materials
| Acrylic glue | Evonik | 1133 | Acrifix 1S 0116 |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8505K725 | Or different company |
| Adhesive tape | Scotch | 3M 810 | Scotch Magic tape |
| Autoclave | Systec | D-200 | Or different company |
| Benchtop centrifuge | Fisher Scientific | 75002451 | Or different company |
| Bungee cord | Paracord Planet | 667569184000 | Or different company |
| Centrifuge tube – 2 mL | Sigma Aldrich | BR780546-500EA | Eppendorf tube |
| Conical centrifuge tube – 15 mL | Fisher Scientific | 11507411 | Falcon tube |
| Conical centrifuge tube – 50 mL | Fisher Scientific | 10788561 | Falcon tube |
| Deployment arm | Irwin | 1964719 | Or different company |
| Deployment enclosure plug | Fisher Scientific | 21-236-4 | See alternatives in manuscript |
| Disposable wipers | Kimtech – Fisher Scientific | 06-666 | Kimwipes |
| Flow cytometer | Beckman | C09756 | CYTOFlex |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma Aldrich | G5882 | Or different company |
| Green fluorescent dye | Sigma Aldrich | S9430 | SYBR Green I – 1:10,000 final dilution |
| Hydrophilic GP filter cartridge – 0.2 µm | Merck | C3235 | Sterivex filter |
| In Situ Chemotaxis Assay (ISCA) | – | – | Contact corresponding authors |
| Laser cutter | Epilog Laser | Fusion pro 32 | Or different company |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Or different company |
| Marine Broth 2216 | VWR | 90004-006 | Difco |
| Nylon slotted flat head screws | McMaster-Carr | 92929A243 | M 2 × 4 × 8 mm |
| Pipette set | Fisher Scientific | 05-403-151 | Or different company |
| Pipette tips – 1 mL | Fisher Scientific | 21-236-2A | Or different company |
| Pipette tips – 20 µL | Fisher Scientific | 21-236-4 | Or different company |
| Pipette tips – 200 µL | Fisher Scientific | 21-236-1 | Or different company |
| Sea salt | Sigma Aldrich | S9883 | For artificial seawater |
| Serological pipette – 50 mL | Sigma Aldrich | SIAL1490-100EA | Or different company |
| Syringe filter – 0.02 µm | Whatman | WHA68091002 | Anatop filter |
| Syringe filter – 0.2 µm | Fisher Scientific | 10695211 | Or different company |
| Syringe needle 27G | Henke Sass Wolf | 4710004020 | 0.4 × 12 mm |
| Syringes – 1 mL | Codau | 329650 | Insulin Luer U-100 |
| Syringes – 10 mL | BD | 303134 | Or different company |
| Syringes – 50 mL | BD | 15899152 | Or different company |
| Tube rack – 15 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Tube rack – 50 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap | McMaster-Carr | 8305A77 | Or different company |
| Vacuum filter – 0.2 µm | Merck | SCGPS05RE | Steritop filter |
References
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