In Situ Chemotaxis Assay para examinar o comportamento microbiano em ecossistemas aquáticos
Summary
Apresentado aqui está o protocolo para um ensaio in situ chemotaxis, um dispositivo microfluido recentemente desenvolvido que permite estudos de comportamento microbiano diretamente no ambiente.
Abstract
Comportamentos microbianos, como motilidade e quimiotaxis (a capacidade de uma célula alterar seu movimento em resposta a um gradiente químico), são difundidos através dos domínios bacteriano e arqueológico. A quimiotaxis pode resultar em vantagens substanciais de aquisição de recursos em ambientes heterogêneos. Também desempenha um papel crucial nas interações simbióticas, doenças e processos globais, como o ciclismo biogeoquímico. No entanto, as técnicas atuais restringem a pesquisa de quimitaxis ao laboratório e não são facilmente aplicáveis no campo. Apresentado aqui é um protocolo passo-a-passo para a implantação do ensaio in situ chemotaxis (ISCA), um dispositivo que permite um interrogatório robusto de quimitaxis microbianas diretamente no ambiente natural. O ISCA é um dispositivo microfluido que consiste em uma matriz de 20 poços, na qual produtos químicos de interesse podem ser carregados. Uma vez implantados em ambientes aquosos, os produtos químicos difundem-se dos poços, criando gradientes de concentração que os micróbios sentem e respondem nadando nos poços via quimiotaxis. Os conteúdos do poço podem então ser amostrados e utilizados para (1) quantificar a força das respostas quimotacticas a compostos específicos através da citometria de fluxo, (2) microrganismos responsivos isolados e culturais, e (3) caracterizar a identidade e o potencial genômico das populações que respondem através de técnicas moleculares. O ISCA é uma plataforma flexível que pode ser implantada em qualquer sistema com uma fase aquosa, incluindo ambientes marinhos, de água doce e solo.
Introduction
Diversos microrganismos usam motilidade e quimiotaxis para explorar ambientes de nutrientes irregulares, encontrar hospedeiros ou evitar condições deletérios1,,2,3. Esses comportamentos microbianos podem, por sua vez, influenciar as taxas de transformação química4 e promover parcerias simbióticas entre os ecossistemas terrestres, de água doce e marinha2,,5.
A quimiotaxis tem sido extensivamente estudada em condições laboratoriais nos últimos 60 anos. O primeiro método quantitativo para estudar quimiotaxis, o ensaio capilar, envolve um tubo capilar preenchido com um quimioattractant putativo imerso em uma suspensão de bactérias6. A difusão do produto químico fora do tubo cria um gradiente químico, e as bactérias quimotacticas respondem a este gradiente migrando para o tubo7. Desde o desenvolvimento do ensaio capilar, ainda amplamente utilizado hoje, muitas outras técnicas têm sido desenvolvidas para estudar quimotáxis em condições físicas/químicas cada vez mais controladas, com a mais recente envolvendo o uso de microfluidos8,,9,,10.
Microfluidos, juntamente com microscopia de vídeo de alta velocidade, permite o rastreamento do comportamento de células únicas em resposta a gradientes cuidadosamente controlados. Embora essas técnicas tenham melhorado muito nossa compreensão das quimotáxis, elas foram restritas ao uso laboratorial e não se traduzem facilmente na implantação de campo em sistemas ambientais. Como consequência, a capacidade das comunidades naturais de bactérias de usar quimitaxis dentro dos ecossistemas naturais não foi examinada; assim, a compreensão atual da potencial importância ecológica da quimiotaxis é tendenciosa em relação às condições artificiais de laboratório e a um número limitado de isolados bacterianos cultivados em laboratório. O ISCA recém-desenvolvido supera essas limitações11.
A ISCA baseia-se no princípio geral do ensaio capilar; no entanto, faz uso de técnicas modernas de microfabricação para fornecer uma plataforma experimental altamente replicada e facilmente implantável para a quantificação de quimitaxis em direção a compostos de interesse no ambiente natural. Também permite a identificação e caracterização de microrganismos quimotacticos por meio de isolamento direto ou técnicas moleculares. Enquanto o primeiro dispositivo de trabalho foi auto-fabricado e construído de vidro e PDMS11, a versão mais recente moldada por injeção é composta de policarbonato, usando um procedimento de fabricação altamente padronizado (para interesse na versão mais recente do dispositivo, os autores correspondentes podem ser contatados).
O ISCA é do tamanho de um cartão de crédito e consiste em 20 poços distribuídos em uma matriz de poços 5 x 4, cada um ligado ao ambiente aquático externo por uma pequena porta (800 μm de diâmetro; Figura 1). Quimioattractants putativos carregados nos poços difusam para o meio ambiente através do porto, e micróbios quimotacticos respondem nadando pelo porto até o poço. Como muitos fatores podem influenciar o resultado de um experimento isca no ambiente natural, este protocolo passo a passo ajudará novos usuários a superar potenciais obstáculos e facilitar implantações eficazes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Na escala dos microrganismos aquáticos, o ambiente está longe de ser homogêneo e muitas vezes é caracterizado por gradientes físicos/químicos que estruturam comunidades microbianas1,,15. A capacidade dos microrganismos motile de usar o comportamento (ou seja, quimiotaxis) facilita o forrageamento dentro desses microambientes heterogêneos1. Estudar quimiotaxis diretamente no ambiente tem o potencial de identificar importantes intera?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi financiada em parte pela Iniciativa de Microbiologia Marinha da Fundação Gordon e Betty Moore, através da concessão GBMF3801 a J.R.S. e R.S., e um Prêmio investigador (GBMF3783) para a R.S., bem como uma Bolsa do Conselho de Pesquisa Australiano (DE160100636) para J.B.R., um prêmio da Simons Foundation para B.S.L. (594111), e uma bolsa da Simons Foundation (542395) para r.S. como parte dos Princípios dos Ecossistemas Microbianos (PriME) Colaborativo.
Materials
| Acrylic glue | Evonik | 1133 | Acrifix 1S 0116 |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8505K725 | Or different company |
| Adhesive tape | Scotch | 3M 810 | Scotch Magic tape |
| Autoclave | Systec | D-200 | Or different company |
| Benchtop centrifuge | Fisher Scientific | 75002451 | Or different company |
| Bungee cord | Paracord Planet | 667569184000 | Or different company |
| Centrifuge tube – 2 mL | Sigma Aldrich | BR780546-500EA | Eppendorf tube |
| Conical centrifuge tube – 15 mL | Fisher Scientific | 11507411 | Falcon tube |
| Conical centrifuge tube – 50 mL | Fisher Scientific | 10788561 | Falcon tube |
| Deployment arm | Irwin | 1964719 | Or different company |
| Deployment enclosure plug | Fisher Scientific | 21-236-4 | See alternatives in manuscript |
| Disposable wipers | Kimtech – Fisher Scientific | 06-666 | Kimwipes |
| Flow cytometer | Beckman | C09756 | CYTOFlex |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma Aldrich | G5882 | Or different company |
| Green fluorescent dye | Sigma Aldrich | S9430 | SYBR Green I – 1:10,000 final dilution |
| Hydrophilic GP filter cartridge – 0.2 µm | Merck | C3235 | Sterivex filter |
| In Situ Chemotaxis Assay (ISCA) | – | – | Contact corresponding authors |
| Laser cutter | Epilog Laser | Fusion pro 32 | Or different company |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Or different company |
| Marine Broth 2216 | VWR | 90004-006 | Difco |
| Nylon slotted flat head screws | McMaster-Carr | 92929A243 | M 2 × 4 × 8 mm |
| Pipette set | Fisher Scientific | 05-403-151 | Or different company |
| Pipette tips – 1 mL | Fisher Scientific | 21-236-2A | Or different company |
| Pipette tips – 20 µL | Fisher Scientific | 21-236-4 | Or different company |
| Pipette tips – 200 µL | Fisher Scientific | 21-236-1 | Or different company |
| Sea salt | Sigma Aldrich | S9883 | For artificial seawater |
| Serological pipette – 50 mL | Sigma Aldrich | SIAL1490-100EA | Or different company |
| Syringe filter – 0.02 µm | Whatman | WHA68091002 | Anatop filter |
| Syringe filter – 0.2 µm | Fisher Scientific | 10695211 | Or different company |
| Syringe needle 27G | Henke Sass Wolf | 4710004020 | 0.4 × 12 mm |
| Syringes – 1 mL | Codau | 329650 | Insulin Luer U-100 |
| Syringes – 10 mL | BD | 303134 | Or different company |
| Syringes – 50 mL | BD | 15899152 | Or different company |
| Tube rack – 15 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Tube rack – 50 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap | McMaster-Carr | 8305A77 | Or different company |
| Vacuum filter – 0.2 µm | Merck | SCGPS05RE | Steritop filter |
References
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