In Situ Chemotaxis Assay per esaminare il comportamento microbico negli ecosistemi acquatici
Summary
Presentato qui è il protocollo per un saggio chemiotaxis in situ, un dispositivo microfluidico recentemente sviluppato che consente studi di comportamento microbico direttamente nell’ambiente.
Abstract
I comportamenti microbici, come la motilità e la chemiotaxis (la capacità di una cellula di alterare il suo movimento in risposta a un gradiente chimico), sono diffusi nei domini batterici e archeali. La chemitaxis può comportare notevoli vantaggi di acquisizione delle risorse in ambienti eterogenei. Svolge anche un ruolo cruciale nelle interazioni simbiotiche, nelle malattie e nei processi globali, come il ciclo biogeochimico. Tuttavia, le tecniche attuali limitano la ricerca sulla chemiotaxis al laboratorio e non sono facilmente applicabili sul campo. Presentato qui è un protocollo passo-passo per la distribuzione del saggio in situ chemiotaxis (ISCA), un dispositivo che consente un robusto interrogatorio di chemiotaxis microbica direttamente nell’ambiente naturale. L’ISCA è un dispositivo microfluidico costituito da un array di 20 possilui, in cui possono essere caricate sostanze chimiche di interesse. Una volta impiegate in ambienti aque, le sostanze chimiche si diffondono fuori dai pozzi, creando gradienti di concentrazione che i microbi percepiscono e rispondono nuotando nei pozzi tramite chemiotaxis. Il contenuto dei beni può quindi essere campionato e utilizzato per (1) quantificare la forza delle risposte chemiotatiche a composti specifici attraverso la citometria del flusso, (2) i microrganismi reattivi isolati e della coltura e (3) caratterizzare l’identità e il potenziale genomico delle popolazioni che rispondono attraverso tecniche molecolari. L’ISCA è una piattaforma flessibile che può essere impiegata in qualsiasi sistema con una fase molto aque, compresi gli ambienti marini, d’acqua dolce e del suolo.
Introduction
Diversi microrganismi utilizzano motilità e chemiotaxis per sfruttare ambienti nutritivi patchy, trovare ospiti, o evitare condizioni deleteri1,2,3. Questi comportamenti microbici possono a loro volta influenzare i tassi di trasformazione chimica4 e promuovere partenariati simbiotici tra gli ecosistemi terrestri, d’acqua dolce e marini2,5.
La chemitaxis è stata ampiamente studiata in condizioni di laboratorio negli ultimi 60 anni6. Il primo metodo quantitativo per studiare la chemitaxis, il saggio capillare, prevede un tubo capillare riempito con un chemoattractant putativo immerso in una sospensione del batterio6. La diffusione della sostanza chimica fuori dal tubo crea un gradiente chimico, e i batteri chemiotatici rispondono a questo gradiente migrando nel tubo7. Dallo sviluppo del saggio capillare, ancora oggi ampiamente utilizzato, molte altre tecniche sono state sviluppate per studiare la chemiotassi in condizioni fisiche/chimiche sempre più controllate, con la più recente che prevede l’uso di microfluidics8,9,10.
La microfluidica, insieme alla microscopia video ad alta velocità, consente di monitorare il comportamento delle singole cellule in risposta a gradienti attentamente controllati. Anche se queste tecniche hanno notevolmente migliorato la nostra comprensione della chemiotaxis, sono state limitate all’uso di laboratorio e non si traducono facilmente nella distribuzione sul campo nei sistemi ambientali. Di conseguenza, la capacità delle comunità naturali di batteri di utilizzare la chemitaxis all’interno degli ecosistemi naturali non è stata esaminata; pertanto, l’attuale comprensione della potenziale importanza ecologica della chemiotassi è prevenita verso le condizioni di laboratorio artificiali e un numero limitato di isolati batterici in laboratorio. L’ISCA recentemente sviluppato supera queste limitazioni11.
L’ISCA si basa sul principio generale del saggio capillare; tuttavia, si fa uso di moderne tecniche di microfabbricazione per fornire una piattaforma sperimentale altamente replicata e facilmente distribuibile per la quantificazione della chemiotassi verso composti di interesse nell’ambiente naturale. Permette anche l’identificazione e la caratterizzazione dei microrganismi chemiotattici mediante isolamento diretto o tecniche molecolari. Mentre il primo dispositivo di lavoro è stato auto-fabbricato e costruito in vetro e PDMS11, l’ultima versione a iniezione è composta da policarbonato, utilizzando una procedura di fabbricazione altamente standardizzata (per interesse per l’ultima versione del dispositivo, gli autori corrispondenti possono essere contattati).
L’ISCA è di dimensioni di carta di credito ed è costituito da 20 pozzi distribuiti in un array di pozzi 5 x 4, ciascuno collegato all’ambiente acquatico esterno da una piccola porta (800 m di diametro; figura 1). Chemoattractants putativi caricati nei pozzi si diffondono nell’ambiente attraverso il porto, e i microbi chemiotattici rispondono nuotando attraverso il porto nel pozzo. Poiché molti fattori possono influenzare il risultato di un esperimento ISCA nell’ambiente naturale, questo protocollo passo-passo aiuterà i nuovi utenti a superare potenziali ostacoli e a facilitare distribuzioni efficaci.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alla scala dei microrganismi acquatici, l’ambiente è tutt’altro che omogeneo ed è spesso caratterizzato da gradienti fisici/chimici che strutturano le comunità microbiche1,15. La capacità dei microrganismi motile di utilizzare il comportamento (cioè la chemiotaxis) facilita il foraggiamento all’interno di questi microambimi eterogenei1. Lo studio della chemitaxis direttamente nell’ambiente ha il potenziale per identificare importanti …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata finanziata in parte dalla Gordon and Betty Moore Foundation Marine Microbiology Initiative, attraverso la sovvenzione GBMF3801 a J.R.S. e R.S., e un Investigator Award (GBMF3783) a R.S., così come una borsa di studio dell’Australian Research Council (DE160100636) a J.B.R., un premio della Simons Foundation a B.S.L. (5941111), e una sovvenzione dalla Simons Foundation (542395) a R.S. come parte dei Principi di Ecosistema Microbiale (PriME) PriME.
Materials
| Acrylic glue | Evonik | 1133 | Acrifix 1S 0116 |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8505K725 | Or different company |
| Adhesive tape | Scotch | 3M 810 | Scotch Magic tape |
| Autoclave | Systec | D-200 | Or different company |
| Benchtop centrifuge | Fisher Scientific | 75002451 | Or different company |
| Bungee cord | Paracord Planet | 667569184000 | Or different company |
| Centrifuge tube – 2 mL | Sigma Aldrich | BR780546-500EA | Eppendorf tube |
| Conical centrifuge tube – 15 mL | Fisher Scientific | 11507411 | Falcon tube |
| Conical centrifuge tube – 50 mL | Fisher Scientific | 10788561 | Falcon tube |
| Deployment arm | Irwin | 1964719 | Or different company |
| Deployment enclosure plug | Fisher Scientific | 21-236-4 | See alternatives in manuscript |
| Disposable wipers | Kimtech – Fisher Scientific | 06-666 | Kimwipes |
| Flow cytometer | Beckman | C09756 | CYTOFlex |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma Aldrich | G5882 | Or different company |
| Green fluorescent dye | Sigma Aldrich | S9430 | SYBR Green I – 1:10,000 final dilution |
| Hydrophilic GP filter cartridge – 0.2 µm | Merck | C3235 | Sterivex filter |
| In Situ Chemotaxis Assay (ISCA) | – | – | Contact corresponding authors |
| Laser cutter | Epilog Laser | Fusion pro 32 | Or different company |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Or different company |
| Marine Broth 2216 | VWR | 90004-006 | Difco |
| Nylon slotted flat head screws | McMaster-Carr | 92929A243 | M 2 × 4 × 8 mm |
| Pipette set | Fisher Scientific | 05-403-151 | Or different company |
| Pipette tips – 1 mL | Fisher Scientific | 21-236-2A | Or different company |
| Pipette tips – 20 µL | Fisher Scientific | 21-236-4 | Or different company |
| Pipette tips – 200 µL | Fisher Scientific | 21-236-1 | Or different company |
| Sea salt | Sigma Aldrich | S9883 | For artificial seawater |
| Serological pipette – 50 mL | Sigma Aldrich | SIAL1490-100EA | Or different company |
| Syringe filter – 0.02 µm | Whatman | WHA68091002 | Anatop filter |
| Syringe filter – 0.2 µm | Fisher Scientific | 10695211 | Or different company |
| Syringe needle 27G | Henke Sass Wolf | 4710004020 | 0.4 × 12 mm |
| Syringes – 1 mL | Codau | 329650 | Insulin Luer U-100 |
| Syringes – 10 mL | BD | 303134 | Or different company |
| Syringes – 50 mL | BD | 15899152 | Or different company |
| Tube rack – 15 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Tube rack – 50 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap | McMaster-Carr | 8305A77 | Or different company |
| Vacuum filter – 0.2 µm | Merck | SCGPS05RE | Steritop filter |
References
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