In Situ Chemotaxis Analyse for å undersøke mikrobiell atferd i akvatiske økosystemer
Summary
Presentert her er protokollen for en in situ chemotaxis analyse, en nylig utviklet mikrofluidisk enhet som muliggjør studier av mikrobiell oppførsel direkte i miljøet.
Abstract
Mikrobiell atferd, som motilitet og chemotaxis (en celles evne til å endre bevegelsen som svar på en kjemisk gradient), er utbredt på tvers av bakterielle og arkaeale domener. Chemotaxis kan resultere i betydelige ressursoppkjøpsfordeler i heterogene miljøer. Det spiller også en avgjørende rolle i symbiotiske interaksjoner, sykdom og globale prosesser, som biogeokjemisk sykling. Imidlertid begrenser dagens teknikker chemotaxis forskning til laboratoriet og er ikke lett aktuelt i feltet. Presentert her er en trinnvis protokoll for utplassering av in situ chemotaxis analyse (ISCA), en enhet som muliggjør robust avhør av mikrobielle chemotaxis direkte i det naturlige miljøet. ISCA er en mikrofluidisk enhet bestående av en 20 brønnarray, hvor kjemikalier av interesse kan lastes. Når de er utplassert i vandige miljøer, sprer kjemikalier seg ut av brønnene, og skaper konsentrasjonsgradienter som mikrober fornemmer og reagerer på ved å svømme inn i brønnene via chemotaxis. Brønninnholdet kan deretter samples og brukes til å (1) kvantifisere styrken til de chemotaktiske reaksjonene på spesifikke forbindelser gjennom strømningscytometri, (2) isolere og kulturresponsive mikroorganismer, og (3) karakteriserer identiteten og genomiske potensialet til de responderende populasjonene gjennom molekylære teknikker. ISCA er en fleksibel plattform som kan distribueres i alle system med en vandig fase, inkludert marine, ferskvann og jordmiljøer.
Introduction
Ulike mikroorganismer bruker motilitet og chemotaxis for å utnytte usammenhengende næringsmiljøer, finne verter eller unngå skadeligeforhold 1,,2,,3. Disse mikrobielle atferdene kan igjen påvirke frekvensen av kjemisk transformasjon4 og fremme symbiotiske partnerskap på tvers av terrestriske, ferskvann og marine økosystemer2,,5.
Chemotaxis har blitt grundig studert under laboratorieforhold de siste 60 årene6. Den første kvantitative metoden for å studere chemotaxis, kapillæranalysen, innebærer et kapillærrør fylt med et antatt kjemoattractant nedsenket i en suspensjon av bakterier6. Diffusjon av kjemikaliet ut av røret skaper en kjemisk gradient, og chemotaktiske bakterier reagerer på denne gradienten ved å migrere inn irøret 7. Siden utviklingen av kapillæranalysen, fortsatt mye brukt i dag, har mange andre teknikker blitt utviklet for å studere chemotaxis under stadig mer kontrollerte fysiske / kjemiske forhold, med den nyeste som involverer bruk av mikrofluidics8,9,10.
Mikrofluidiker, sammen med høyhastighets videomikroskopi, muliggjør sporing av oppførselen til enkeltceller som svar på nøye kontrollerte graderinger. Selv om disse teknikkene har forbedret vår forståelse av chemotaxis, har de blitt begrenset til laboratoriebruk og oversetter ikke lett til feltdistribusjon i miljøsystemer. Som en konsekvens har kapasiteten til naturlige samfunn av bakterier til å bruke chemotaxis i naturlige økosystemer ikke blitt undersøkt; Dermed er dagens forståelse av den potensielle økologiske betydningen av chemotaxis partisk mot kunstige laboratorieforhold og et begrenset antall laboratoriekulturerte bakterielle isolater. Den nylig utviklede ISCA overvinner disse begrensningene11.
ISCA bygger på det generelle prinsippet om kapillæranalysen; Det gjør det imidlertid bruk av moderne mikrofabrikasjonsteknikker for å levere en svært replikert, lett deployerbar eksperimentell plattform for kvantifisering av chemotaxis mot forbindelser av interesse for det naturlige miljøet. Det tillater også identifisering og karakterisering av chemotaktiske mikroorganismer ved direkte isolasjon eller molekylære teknikker. Mens den første arbeidsenheten var selvfablantert og konstruert av glass og PDMS11,består den nyeste injeksjonsstøpte versjonen av polykarbonat, ved hjelp av en svært standardisert fabrikasjonsprosedyre (for interesse for den nyeste versjonen av enheten, kan de tilsvarende forfatterne kontaktes).
ISCA er kredittkortstørrelse og består av 20 brønner fordelt i en 5 x 4 brønnarray, hver knyttet til det ytre vannmiljøet med en liten port (800 μm i diameter; Figur 1). Antatte kjemoattractants lastet inn i brønnene sprer seg inn i miljøet via havnen, og kjemotaktiske mikrober reagerer ved å svømme gjennom havnen inn i brønnen. Så mange faktorer kan påvirke utfallet av et ISCA-eksperiment i det naturlige miljøet, vil denne trinnvise protokollen hjelpe nye brukere med å overvinne potensielle hindringer og legge til rette for effektive distribusjoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
På omfanget av akvatiske mikroorganismer er miljøet langt fra homogent og er ofte preget av fysiske / kjemiske gradienter som strukturerer mikrobielle samfunn1,15. Kapasiteten til motile mikroorganismer til å bruke atferd (det vil si chemotaxis) letter foraging innenfor disse heterogene mikromiljøene1. Å studere chemotaxis direkte i miljøet har potensial til å identifisere viktige interspesifikke interaksjoner og kjemiske preferanse…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble delvis finansiert av Gordon og Betty Moore Foundation Marine Microbiology Initiative, gjennom å gi GBMF3801 til J.R.S. og R.S., og en Investigator Award (GBMF3783) til R.S., samt en Australian Research Council Fellowship (DE160100636) til J.B.R., en pris fra Simons Foundation til B.S.L. (594111), og et stipend fra Simons Foundation (542395) til R.S. som en del av prinsippene for mikrobielle økosystemer (PriME) Collaborative.
Materials
| Acrylic glue | Evonik | 1133 | Acrifix 1S 0116 |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8505K725 | Or different company |
| Adhesive tape | Scotch | 3M 810 | Scotch Magic tape |
| Autoclave | Systec | D-200 | Or different company |
| Benchtop centrifuge | Fisher Scientific | 75002451 | Or different company |
| Bungee cord | Paracord Planet | 667569184000 | Or different company |
| Centrifuge tube – 2 mL | Sigma Aldrich | BR780546-500EA | Eppendorf tube |
| Conical centrifuge tube – 15 mL | Fisher Scientific | 11507411 | Falcon tube |
| Conical centrifuge tube – 50 mL | Fisher Scientific | 10788561 | Falcon tube |
| Deployment arm | Irwin | 1964719 | Or different company |
| Deployment enclosure plug | Fisher Scientific | 21-236-4 | See alternatives in manuscript |
| Disposable wipers | Kimtech – Fisher Scientific | 06-666 | Kimwipes |
| Flow cytometer | Beckman | C09756 | CYTOFlex |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma Aldrich | G5882 | Or different company |
| Green fluorescent dye | Sigma Aldrich | S9430 | SYBR Green I – 1:10,000 final dilution |
| Hydrophilic GP filter cartridge – 0.2 µm | Merck | C3235 | Sterivex filter |
| In Situ Chemotaxis Assay (ISCA) | – | – | Contact corresponding authors |
| Laser cutter | Epilog Laser | Fusion pro 32 | Or different company |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Or different company |
| Marine Broth 2216 | VWR | 90004-006 | Difco |
| Nylon slotted flat head screws | McMaster-Carr | 92929A243 | M 2 × 4 × 8 mm |
| Pipette set | Fisher Scientific | 05-403-151 | Or different company |
| Pipette tips – 1 mL | Fisher Scientific | 21-236-2A | Or different company |
| Pipette tips – 20 µL | Fisher Scientific | 21-236-4 | Or different company |
| Pipette tips – 200 µL | Fisher Scientific | 21-236-1 | Or different company |
| Sea salt | Sigma Aldrich | S9883 | For artificial seawater |
| Serological pipette – 50 mL | Sigma Aldrich | SIAL1490-100EA | Or different company |
| Syringe filter – 0.02 µm | Whatman | WHA68091002 | Anatop filter |
| Syringe filter – 0.2 µm | Fisher Scientific | 10695211 | Or different company |
| Syringe needle 27G | Henke Sass Wolf | 4710004020 | 0.4 × 12 mm |
| Syringes – 1 mL | Codau | 329650 | Insulin Luer U-100 |
| Syringes – 10 mL | BD | 303134 | Or different company |
| Syringes – 50 mL | BD | 15899152 | Or different company |
| Tube rack – 15 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Tube rack – 50 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap | McMaster-Carr | 8305A77 | Or different company |
| Vacuum filter – 0.2 µm | Merck | SCGPS05RE | Steritop filter |
References
- Stocker, R. Marine microbes see a sea of gradients. Science. 338, 628-633 (2012).
- Raina, J. B., Fernandez, V., Lambert, B., Stocker, R., Seymour, J. R. The role of microbial motility and chemotaxis in symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 17, 284-294 (2019).
- Chet, I., Asketh, P., Mitchell, R. Repulsion of bacteria from marine surfaces. Applied Microbiology. 30, 1043-1045 (1975).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. PNAS. 113, 1576-1581 (2016).
- Matilla, M., Krell, T. The effect of bacterial chemotaxis on host infection and pathogenicity. FEMS Microbiology Reviews. 42, (2018).
- Adler, J. Chemotaxis in bacteria. Science. 153, 708-716 (1966).
- Adler, J., Dahl, M. M. A method for measuring the motility of bacteria and for comparing random and non-random motility. Journal of General Microbiology. 46, 161-173 (1967).
- Ahmed, T., Shimizu, T. S., Stocker, R. Microfluidics for bacterial chemotaxis. Integrative Biology. 2, 604-629 (2010).
- Hol, F. J. H., Dekker, C. Zooming in to see the bigger picture: microfluidic and nanofabrication tools to study bacteria. Science. 346, 1251821 (2014).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology. Annual Review of Biophysics. 43, 65-91 (2014).
- Lambert, B. S., et al. A microfluidics-based in situ chemotaxis assay to study the behaviour of aquatic microbial communities. Nature Microbiology. 2, 1344-1349 (2017).
- Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I. Applied Environmental Microbiology. 63, 186-193 (1997).
- Rinke, C., et al. Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics. Nature Protocols. 9, 1038-1048 (2014).
- Gaworzewska, E. T., Carlile, M. J. Positive chemotaxis of Rhizobium leguminosarum and other bacteria towards root exudates from legumes and other plants. Microbiology. , (1982).
- Walker, T. S., Bais, H. P., Grotewold, E., Vivanco, J. M. Root exudation and rhizosphere biology. Plant Physiology. 132, 44-51 (2003).
