In Situ Chemotaxis Assay att undersöka mikrobiellt beteende i akvatiska ekosystem

Summary

Presenteras här är protokollet för en in situ chemotaxis analys, en nyligen utvecklad mikrofluidic enhet som möjliggör studier av mikrobiellt beteende direkt i miljön.

Abstract

Mikrobiella beteenden, såsom motilitet och chemotaxis (förmågan hos en cell att ändra sin rörelse som svar på en kemisk gradient), är utbredd över bakterie-och arkaeala domäner. Chemotaxis kan resultera i betydande resursförvärvsfördelar i heterogena miljöer. Det spelar också en avgörande roll i symbiotiska interaktioner, sjukdomar och globala processer, såsom biogeokemisk cykling. Men nuvarande tekniker begränsar chemotaxis forskning till laboratoriet och är inte lätt tillämpliga inom området. Presenteras här är ett steg-för-steg-protokoll för utplacering av in situ chemotaxis assay (ISCA), en enhet som möjliggör robust förhör av mikrobiell chemotaxis direkt i den naturliga miljön. ISCA är en mikrofluidisk enhet som består av en 20 brunnsmatris, där kemikalier av intresse kan laddas. När de är utplacerade i vattenhaltiga miljöer sprider sig kemikalier ur brunnarna, vilket skapar koncentrationsgradienter som mikrober känner av och reagerar på genom att simma in i brunnarna via chemotaxis. Brunnsinnehållet kan sedan samplas och användas för att (1) kvantifiera styrkan hos de chemotactic svaren på specifika föreningar genom flödescytometri, (2) isolera och kultur lyhörda mikroorganismer, och (3) karakterisera identitet och genomisk potential av de svarande populationerna genom molekylära tekniker. ISCA är en flexibel plattform som kan användas i alla system med en vattenfas, inklusive marina miljöer, sötvatten och jord.

Introduction

Olika mikroorganismer använder motilitet och chemotaxis att utnyttja ojämna näringsmiljöer, hitta värdar, eller undvika skadliga förhållanden^1,2,3. Dessa mikrobiella beteenden kan i sin tur påverka andelen kemisk omvandling^{4 och} främja symbiotiska partnerskap över land-, sötvatten och marina ekosystem^2,5.

Chemotaxis har studerats ingående under laboratorieförhållanden under de senaste 60 åren⁶. Den första kvantitativa metoden för att studera chemotaxis, kapillär analysen, innebär en kapillär röret fylld med en putativ chemoattractant nedsänkt i en suspension av bakterier⁶. Diffusion av kemikalien ut ur röret skapar en kemisk gradient, och chemotactic bakterier svara på denna gradient genom att migrera in i röret⁷. Sedan utvecklingen av kapillär analysen, fortfarande används i stor utsträckning idag, många andra tekniker har utvecklats för att studera chemotaxis under alltmer kontrollerade fysiska / kemiska förhållanden, med den senaste innebär användning av mikrofluidik^8,9,10.

Mikrofluidik, tillsammans med höghastighetsvideomikroskopi, möjliggör spårning av enstaka cellers beteende som svar på noggrant kontrollerade lutningar. Även om dessa tekniker har avsevärt förbättrat vår förståelse av chemotaxis, har de begränsats till laboratorieanvändning och inte översätta lätt till fältutbyggnad i miljösystem. Som en konsekvens har kapaciteten hos naturliga samhällen av bakterier att använda chemotaxis inom naturliga ekosystem inte undersökts; således är nuvarande förståelse av den potentiella ekologiska betydelsen av chemotaxis partisk mot konstgjorda laboratorieförhållanden och ett begränsat antal laboratorie-odlade bakteriell isolat. Den nyligen utvecklade ISCA övervinner dessa begränsningar¹¹.

ISCA bygger vidare på den allmänna principen om kapilläranalysen; emellertid, Det använder sig av moderna mikrofabricering tekniker för att leverera en mycket replikerade, lätt deployable experimentell plattform för kvantifiering av chemotaxis mot föreningar av intresse för den naturliga miljön. Det möjliggör också identifiering och karakterisering av chemotactic mikroorganismer genom direkt isolering eller molekylära tekniker. Medan den första fungerande enheten var själv fabricerade och konstruerade av glas och PDMS¹¹, den senaste formsprutade versionen är sammansatt av polykarbonat, med hjälp av en mycket standardiserad tillverkning förfarande (för intresse för den senaste versionen av enheten, kan motsvarande författare kontaktas).

ISCA är kreditkortsstor och består av 20 brunnar fördelade i en 5 x 4 brunnsarray, var och en kopplad till den yttre vattenmiljön av en liten hamn (800 μm i diameter; Bild 1). Förmodade kemoattrater lastade i brunnarna diffusa i miljön via hamnen, och chemotactic mikrober svara genom att simma genom hamnen i brunnen. Eftersom många faktorer kan påverka resultatet av ett ISCA-experiment i den naturliga miljön, kommer detta steg-för-steg-protokoll att hjälpa nya användare att övervinna potentiella hinder och underlätta effektiva distributioner.

Protocol

Vi rekommenderar att du utför avsnitt 1 före fältexperiment för att optimera resultaten. 1. Optimering av laboratorium OBS: De volymer som beskrivs i optimeringsförfarandet är tillräckliga för en enda ISCA (som består av 20 brunnar). Förberedelse av kemikalien av intresseOBS: Den optimala koncentrationen för varje kemoattratant behöver ofta bestämmas under laboratorieförhållanden före fältutplaceringar. Det kemiska koncentrationsfälte…

Representative Results

Detta avsnitt presenterar laboratorieresultat med hjälp av ISCA för att testa den chemotactic svar marina mikrober till en koncentrationsintervall av glutamin, en aminosyra kända för att locka jordbakterier14. Koncentrationen av glutamin som framkallat den starkaste chemotactic svaret i laboratorietesterna användes för att utföra en chemotaxis analys i den marina miljön. För att utföra laboratorietesterna berikades havsvattensamhällen som provsmakades från k…

Discussion

På skalan av vattenlevande mikroorganismer, är miljön långt ifrån homogen och kännetecknas ofta av fysikaliska / kemiska gradienter som strukturerar mikrobiella samhällen^1,15. Kapaciteten hos motil mikroorganismer att använda beteende (dvs. chemotaxis) underlättar födosök inom dessa heterogena mikromiljöer¹. Att studera kemotaxis direkt i miljön har potential att identifiera viktiga interspecifika interaktioner och kemiska pre…

Materials

Acrylic glue	Evonik	1133	Acrifix 1S 0116
Acrylic sheet	McMaster-Carr	8505K725	Or different company
Adhesive tape	Scotch	3M 810	Scotch Magic tape
Autoclave	Systec	D-200	Or different company
Benchtop centrifuge	Fisher Scientific	75002451	Or different company
Bungee cord	Paracord Planet	667569184000	Or different company
Centrifuge tube – 2 mL	Sigma Aldrich	BR780546-500EA	Eppendorf tube
Conical centrifuge tube – 15 mL	Fisher Scientific	11507411	Falcon tube
Conical centrifuge tube – 50 mL	Fisher Scientific	10788561	Falcon tube
Deployment arm	Irwin	1964719	Or different company
Deployment enclosure plug	Fisher Scientific	21-236-4	See alternatives in manuscript
Disposable wipers	Kimtech – Fisher Scientific	06-666	Kimwipes
Flow cytometer	Beckman	C09756	CYTOFlex
Glutaraldehyde 25%	Sigma Aldrich	G5882	Or different company
Green fluorescent dye	Sigma Aldrich	S9430	SYBR Green I – 1:10,000 final dilution
Hydrophilic GP filter cartridge – 0.2 µm	Merck	C3235	Sterivex filter
In Situ Chemotaxis Assay (ISCA)	–	–	Contact corresponding authors
Laser cutter	Epilog Laser	Fusion pro 32	Or different company
Luria Bertani Broth	Sigma Aldrich	L3022	Or different company
Marine Broth 2216	VWR	90004-006	Difco
Nylon slotted flat head screws	McMaster-Carr	92929A243	M 2 × 4 × 8 mm
Pipette set	Fisher Scientific	05-403-151	Or different company
Pipette tips – 1 mL	Fisher Scientific	21-236-2A	Or different company
Pipette tips – 20 µL	Fisher Scientific	21-236-4	Or different company
Pipette tips – 200 µL	Fisher Scientific	21-236-1	Or different company
Sea salt	Sigma Aldrich	S9883	For artificial seawater
Serological pipette – 50 mL	Sigma Aldrich	SIAL1490-100EA	Or different company
Syringe filter – 0.02 µm	Whatman	WHA68091002	Anatop filter
Syringe filter – 0.2 µm	Fisher Scientific	10695211	Or different company
Syringe needle 27G	Henke Sass Wolf	4710004020	0.4 × 12 mm
Syringes – 1 mL	Codau	329650	Insulin Luer U-100
Syringes – 10 mL	BD	303134	Or different company
Syringes – 50 mL	BD	15899152	Or different company
Tube rack – 15 mL	Thomas Scientific	1159V80	Or different company
Tube rack – 50 mL	Thomas Scientific	1159V80	Or different company
Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap	McMaster-Carr	8305A77	Or different company
Vacuum filter – 0.2 µm	Merck	SCGPS05RE	Steritop filter