자기 측정을 사용하여 화학적으로 합성된 산화철 나노 입자의 세포 통합 및 후속 생분해를 모니터링합니다.

Summary

산화철 나노입자는 비수성 솔 젤 시술을 통해 합성되고 음이온 짧은 분자 또는 폴리머로 코팅된다. 인간 줄기 세포 내부의 자기 나노 입자의 통합 및 생체 변환을 모니터링하기 위한 자기 측정의 사용은 진동 시료 자력계(VSM)를 사용하여 입증된다.

Abstract

산화철로 만든 마그네틱 나노입자는 세포에서 종종 내면화된 다음 그 안에 남겨지는 광범위한 생물 의학 응용 분야에 대한 특이한 관심을 제시합니다. 한 가지 과제는 안정적이고 정밀한 방법론으로 세포 내 환경에서 자신의 운명을 평가하는 것입니다. 본원에서, 우리는 자기 모멘티브를 측정하여 세포 내자기 나노 입자의 무결성을 정확하게 정량화하기 위해 진동 시료 자력계(VSM)의 사용을 소개합니다. 줄기 세포는 먼저 자기 나노 입자의 두 가지 유형으로 표시; 나노 입자는 빠르고 효율적인 마이크로파 기반의 비수성 솔 젤 합성을 통해 생성되는 동일한 코어를 가지며 코팅이 다릅니다: 일반적으로 사용되는 구연산 분자는 폴리아크릴산과 비교된다. 3D 세포-스페로이드의 형성은 원심분리를 통해 달성되고 이러한 스페로이드의 자기 모멘트는 VSM과 다른 시간에 측정된다. 얻어진 모멘트는 나노입자의 무결성의 직접적인 지문이며, 나노입자 분해를 나타내는 값이 감소합니다. 두 나노 입자의 경우 자기 모멘은 배양 시간이 지남에 따라 감소하여 생분해를 드러냅니다. 구연산과 비교했을 때 폴리아크릴산 코팅의 보호 효과도 나타난다.

Introduction

광범위한 생체 의학 응용 분야에 대한 산화철 나노 입자의 자기 기능에 대한 관심이 증가합니다. 자기 공명에 대한 그들의 반응은 자기 공명 화상 진찰을 위한 믿을 수 있는 조영제를 만듭니다 (MRI), 자기 나노 입자로 표지된 세포가 이식^1다음생체내에서 추적될 수 있는 재생 의학에서 이점. 자기장을 사용하여, 세포는 또한 거리에서 유도 될 수있다; 이러한 방식으로, 셀룰러 스페로이드^2,3,링^4,또는 시트^5는 자기적으로 설계될 수 있으며, 또한 원격으로^자극6,비계없는 조직의 개발에 있는 자산이다. 이들 나노입자에 대한 가능성의 범위는 또한 약물 전달 시스템^7,8 및 자기 및 광유도 열 처리를 포함하여 암세포를 죽이는^9,10,11을포함한다. 이러한 모든 응용 분야에서, 나노 입자는 정맥 주사 또는 세포의 직접 내재화를 통해 생물학적 환경에 통합된 다음 내부에 남아 있으며, 이는 세포 내 운명에 의문을 제기합니다.

생체 내 분석에서 유기체에서 나노 입자의 운명에 대한 일반적인 이해를 전달 : 혈류에서 주입시, 그들은 먼저 간 (Kupffer 세포),비장과 골수의 대식세포에 의해 주로 캡처되고, 점진적으로 저하되고, 유기체의 철풀에 가입^{12,13,14,15,16,17, 18,18.} 질적 관측은 유기체 전체에 걸쳐 나노 입자의 순환으로 인해 가능하다. 전형적으로, 전송 전자 현미경검사(TEM)는 나노입자를 직접 관찰하는 데 사용될 수 있으며 장기내철의 존재는 투여를 통해 결정될 수 있다. 최근에는 철분 탈출없이 가까운 회로에서 세포 수면에서 직접 평가되어 세포 수준^{20,21,22에서}생체 변환을 정량적으로 측정할 수 있습니다. 이러한 측정은 구조적 무결성에 단단히 연결된 나노 입자의 자기 특성 분석을 통해 가능합니다. 진동 시료 자기측정(VSM)은 시료가 주기적으로 진동하여 유도된 플럭스의 코일 측정이 적용된 자기장에서 시료의 자기 모멘트를 제공하는 기술이다. 이러한 동기 검출을 통해 많은 수의시료(20,^21,22,23)의자기 순간을 결정하는 자산인 신속한 측정을 가능하게 한다. VSM에서 검색한 거시적 자기 서명은 나노입자의 크기와 구조와 직접 상관관계가 있는 전체 생물학적 시료에 대한 정량적 개요를 제공합니다. 특히, 시료의 포화(emu에서 발현)에서 자기 모멘트를 제공하며, 이는 샘플에 존재하는 자기 나노입자의 수를 각각 특정 자기 특성에 정량화한다.

자기 나노 입자의 세포 내 처리가 구조적^{특징(20)에}단단히 연결되어 있는 것으로 나타났다. 이러한 기능은 최적의 합성 프로토콜을 통해 제어할 수 있습니다. 각 프로토콜은 장점과 한계를 제시합니다. 철산화질소 나노입자는 일반적으로^{철이온(24)의}회량화를 통해 수성 용액에서 합성된다. 나노입자 크기의 다각형의 한계를 극복하기 위해 폴리올 매개 솔겔 방법과 같은 다른 합성 방법이^25개개발되었다. 열 분해에 의한 비수성 접근법은 매우 잘 보정된 산화질소^{나노입자(26)의}생산으로 이어집니다. 그러나, 올리라민 또는 올레산 과 같은 계면 활성제의 엄청난 양의 사용은 생물 의학 응용 프로그램에 대한 기능화 및 물 전송을 복잡하게. 이러한 이유로, 우리는 높은 결정성, 순도 및^{재현성(27)으로}이어지는 비수성 솔 젤 경로를 통해 이러한 자기 나노입자를 합성한다. 이 프로토콜은 온도^{변화(28)를}통해 조정할 수 있는 잘 제어된 크기의 나노입자를 생성한다. 그럼에도 불구하고, 전자레인지지원 비수성 솔젤 경로는 약 12nm의 얻어진 나노입자의 상한한계를 갖는다. 이 절차는 실온에서 강자성 입자를 사용하는 응용 분야에 적용되지 않습니다. 코어 합성 외에도 고려해야 할 또 다른 주요 특징은 코팅입니다. 나노 입자의 표면에 누워, 코팅은 나노 입자의 표적 내재화를 돕는 고정 분자 역할을, 또는 분해로부터 나노 입자를 보호 할 수 있습니다. 벤질 알코올은 산소 공급원과 리간드역할을 동시에 하기 때문에, 베어 나노입자는 추가계활성제 나 리간드없이 생산된다. 나노 입자는 계면 활성제 교환 과정없이 합성 후 쉽게 표면 기능화된다.

본명, 나노입자의 2가지 유형은 동일한 코어를 가지고 코팅이 다른 것으로 평가된다. 코어는 빠르고 매우 효율적인 전자 레인지 기반 기술을 사용하여 합성됩니다. 비교된 두 코팅은 구연산으로 구성되며, 생체 의학 응용 분야에서 코팅제로 가장 많이 사용되는 중^{하나인 29,30,}및 폴리아크릴산(PAA), 다수질 기능의 수가 많은 폴리머 코팅. VSM 자기측정측정은 먼저 세포에 의한 나노입자 섭취를 정량화한 다음 줄기세포의 내재화 시 나노입자 구조적 무결성을 직접 평가하는 데 사용된다. 결과는 인큐베이션 농도가 나노입자 섭취에 영향을 미치고 코팅이 저하에 영향을 미치고 PAA의 많은 수의 앵커링 분자가 저하로부터 코어를 보호한다는 것을 보여줍니다.

Protocol

1. 자기 나노 입자의 합성 코어 합성 – 전자레인지 지원 용해 400 철 (III) 아세틸 레이스토네이트의 mg (>99.9%) 10mL의 벤질 알코올(BA, 99.8%)에서 30mL 단파 유리 유리 바이알 내에서. 서스펜션의 온도를 20분(11.25°C/min의 속도로) 250°C로 높이고 전자레인지 반응기를 사용하여 30분 동안 250°C로 유지한다. 벤질 알코올에 매달린 결과 나노입자를 유리 유리병으로 옮기고 30분 동?…

Representative Results

전자레인지 보조 합성을 사용하여, 단면 8.8 ± 2.5 nm 코어 크기를 가진 자기 나노 입자가 구연산 또는 PAA(도1A)로생성되고 코팅된다. 줄기세포는 30분 동안 주어진 농도로 배양 배지에 분산된 이러한 나노입자로 배양되어 세포 내분(도1B)내내내세포 및 감금을 초래한다. 자기 줄기 세포는 그 때 매체에서 중단되고, 원심분리되고, 형성된 세포 펠릿은 21일까…

Discussion

빠르고 효율적인 마이크로파 기반 합성을 사용하여 자기 나노 입자는 제어 된 크기로 쉽게 합성 할 수 있으며 주어진 분자로 더 코팅 할 수 있습니다. 중요한 단계는 작은 분산을 유지하기 위해 진공 상태에서 철소금과 벤질 알코올을 비축하는 것입니다. 벤질 알코올은 용매와 리간드로 동시에 작용하여 추가 리간드 없이 는 교정된 베어 리산화물을 직접 얻을 수 있습니다. 나노 입자가 물에 전달 …

Materials

0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies	25300-054
Benzyl alcohol for synthesis	Sigma Aldrich	8.22259
Dexamethasone	Sigma	D4902	Prepare a 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C
Dichloromethane ≥99% stabilised, GPR RECTAPUR	VWR Chemicals	23367
DMEM with Glutamax I	Life Technologies	31966-021	No sodium pyruvate, no HEPES
Ethanol absolute	VWR	20821.310
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10270-106
Formalin solution 10% neutral buffered	Sigma	HT5012
Hydrochloric acid, 1.0N Standardized Solution	Alfa Aesar	35640
Iron(III) acetylacetonate (> 99.9%)	Sigma Aldrich	517003
ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)	Corning	354352
L-Ascorbic Acid 2-phosphate	Sigma	A8960	Prepare a fresh concentrated solution (25 mM) diluted in distilled water
L-Proline	Sigma	P5607	Prepare a 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C
Mesenchymal Stem Cell (MSC)	Lonza	PT-2501
Monowave glass vial	Anton Paar	82723_us
Microwave reactor	Anton Paar	Monowave 300
MSCGM BulletKit medium	Lonza	PT-3001	For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium
PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2	Life Technologies	14190-094
Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL)	Life Technologies	15140-122
Poly(acrylic acid, sodium salt)	Sigma Aldrich	416010	MW = 1200 g/mol
RPMI medium 1640, no Glutamine	Life Technologies	31870-025	No sodium pyruvate, no HEPES
Sodium hydroxide, 1.0N Standardized Solution	Alfa Aesar	35629
Sodium pyruvate solution 100mM	Sigma	S8636
Sterile conical centrifuge tube	Falcon	352097	15 mL tubes
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300054
Tri-sodium citrate	VWR	33615.268	Prepare a 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C
Tri-Sodium Citrate Dihydrate, Certified AR for Analysis	Sigma Aldrich	10396430
Ultra centrifugal filter	Amicon	AC S510024