Uso de magnetometría para monitorear la incorporación celular y la posterior biodegradación de nanopartículas de óxido de hierro sintetizadas químicamente
Summary
Las nanopartículas de óxido de hierro se sintetizan a través de un procedimiento de gel sol noaqueoso y están recubiertas con moléculas cortas aniónicas o polímero. El uso de magnetometría para monitorear la incorporación y biotransformaciones de nanopartículas magnéticas dentro de células madre humanas se demuestra utilizando un magnetómetro de muestra vibratoria (VSM).
Abstract
Las nanopartículas magnéticas, hechas de óxido de hierro, presentan un interés peculiar para una amplia gama de aplicaciones biomédicas para las que a menudo se interiorizan en las células y luego se dejan dentro. Un desafío es evaluar su destino en el entorno intracelular con metodologías fiables y precisas. En este documento, introducimos el uso del magnetómetro de la muestra vibratoria (VSM) para cuantificar con precisión la integridad de las nanopartículas magnéticas dentro de las células midiendo su momento magnético. Las células madre se etiquetan por primera vez con dos tipos de nanopartículas magnéticas; las nanopartículas tienen el mismo núcleo producido a través de una síntesis rápida y eficiente de gel sol a base de microondas y difieren en su recubrimiento: la molécula de ácido cítrico comúnmente utilizada se compara con el ácido poliacrílico. La formación de esferoides celulares 3D se logra a través de la centrifugación y el momento magnético de estos esferoides se mide en diferentes momentos con el VSM. El momento obtenido es una huella digital directa de la integridad de las nanopartículas, con valores decrecientes indicativos de una degradación de las nanopartículas. Para ambas nanopartículas, el momento magnético disminuye con el tiempo de cultivo revelando su biodegradación. También se muestra un efecto protector del recubrimiento de ácido poliacrílico, en comparación con el ácido cítrico.
Introduction
Hay un mayor interés en las características magnéticas de las nanopartículas de óxido de hierro para una amplia gama de aplicaciones biomédicas. Su respuesta a la resonancia magnética los convierte en agentes de contraste fiables para la resonancia magnética (RM), una ventaja en la medicina regenerativa donde las células etiquetadas con nanopartículas magnéticas pueden ser rastreadas in vivo después de la implantación1. Utilizando campos magnéticos, las células también se pueden guiar a distancia; de esta manera, los esferoides celulares2,3,anillos4,o hojas5 se pueden diseñar magnéticamente y también estimulado remotamente6,un activo en el desarrollo de tejidos sin andamios. La gama de posibilidades para estas nanopartículas también incluye sistemas de administración de fármacos7,8 y tratamiento hipertérmico magnético y fotoinducido para matar las células cancerosas9,10,11. Para todas estas aplicaciones, las nanopartículas se integran en el entorno biológico, ya sea mediante inyección intravenosa o a través de la internalización directa en las células y luego se dejan dentro, lo que pone en tela de juicio su destino intracelular.
Los análisis in vivo transmitieron una comprensión general del destino de las nanopartículas en el organismo: al inyectarse en el torrente sanguíneo, primero son capturadas en su mayoría por los macrófagos del hígado (células de Kupffer), bazo y médula ósea, se degradan progresivamente, y se unen a la piscina de hierro del organismo12,13,14,15,16,17,18,19. Las observaciones cualitativas sólo son posibles debido a la circulación de las nanopartículas en todo el organismo. Por lo general, la microscopía electrónica de transmisión (TEM) se puede utilizar para observar directamente las nanopartículas y la presencia de hierro en los órganos se puede determinar a través de la dosificación. Más recientemente, su destino ha sido evaluado directamente en un conjunto de células, lo que significa en circuito cercano sin escape de hierro, permitiendo una medición cuantitativa de sus biotransformaciones a nivel celular20,21,22. Tales mediciones son posibles a través del análisis de las propiedades magnéticas de las nanopartículas que están estrechamente vinculadas a su integridad estructural. La magnetometría de muestras vibratorias (VSM) es una técnica en la que la muestra vibra periódicamente para que la medición de la bobina del flujo inducido proporcione el momento magnético de la muestra en el campo magnético aplicado. Dicha detección sincrónica permite una medición rápida, que es un activo para determinar los momentos magnéticos de un gran número de muestras20,21,22,23. La firma magnética macroscópica recuperada por VSM ofrece una visión cuantitativa de toda la muestra biológica directamente correlacionada con el tamaño y la estructura de las nanopartículas. En particular, proporciona el momento magnético en saturación (expresado en emú) de las muestras, que es una cuantificación directa del número de nanopartículas magnéticas presentes en la muestra, respectivamente a sus propiedades magnéticas específicas.
Se ha demostrado que el procesamiento intracelular de nanopartículas magnéticas está estrechamente vinculado a sus características estructurales20. Estas características se pueden controlar a través de protocolos de síntesis óptimos. Cada protocolo presenta ventajas y limitaciones. Las nanopartículas de óxido de hierro se sintetizan comúnmente en soluciones acuosas a través de la coprecipitación de iones de hierro24. Para superar las limitaciones de la polidispersidad del tamaño de las nanopartículas, se han desarrollado otros métodos de síntesis como los métodos sol-gel mediados por poliol25. Los enfoques noaqueos por descomposición térmica conducen a la producción de nanopartículas de óxido de hierro muy bien calibradas26. Sin embargo, el uso de cantidades masivas de tensioactivos como la oleylamina o el ácido oleico complica su funcionalización y transferencia de agua para aplicaciones biomédicas. Por esta razón, sintetizamos tales nanopartículas magnéticas a través de una ruta de gel sol noaqueís que conduce a alta cristalina, pureza y reproducibilidad27. Este protocolo produce nanopartículas de tamaño bien controladas que se pueden ajustar a través de la variación de temperatura28. Sin embargo, la ruta sol-gel no acuosa asistida por microondas tiene un límite de tamaño superior de las nanopartículas obtenidas de alrededor de 12 nm. Este procedimiento no se adaptaría para aplicaciones que utilicen partículas ferromagnéticas a temperatura ambiente. Además de la síntesis del núcleo, otra característica principal a tener en cuenta es el recubrimiento. Acostado en la superficie de la nanopartícula, el revestimiento actúa como una molécula de anclaje, ayudando a la internalización específica de las nanopartículas, o puede proteger la nanopartícula de la degradación. Dado que el alcohol bencílico actúa como una fuente de oxígeno y un ligando al mismo tiempo, las nanopartículas desnudas se producen sin necesidad de tensioactivos o ligandos adicionales. Las nanopartículas se funcionalizan fácilmente después de la síntesis sin un proceso de intercambio de tensioactivos.
En este documento, se evalúan dos tipos de nanopartículas que poseen el mismo núcleo y difieren en el recubrimiento. El núcleo se sintetiza utilizando una técnica rápida y altamente eficiente basada en microondas. Los dos recubrimientos comparados consisten en ácido cítrico, uno de los más utilizados como agente de recubrimiento en aplicaciones biomédicas29,30,y ácido poliacrílico (PAA), un revestimiento polimérico con un alto número de funciones quelantes. Las mediciones de magnetometría VSM se utilizan primero para cuantificar la absorción de nanopartículas por las células, y luego como una evaluación directa de la integridad estructural de las nanopartículas al internalizarse en las células madre. Los resultados demuestran que la concentración de incubación afecta a la absorción de nanopartículas y que el recubrimiento influye en su degradación, con el gran número de moléculas de anclaje de PAA protegiendo el núcleo de la degradación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizando una síntesis rápida y eficiente a base de microondas, las nanopartículas magnéticas se pueden sintetizar fácilmente, con tamaño controlado y recubiertas aún más con moléculas dadas. Un paso crítico es abastecer la sal de hierro y el alcohol bencílico bajo vacío para mantener una pequeña dispersión en tamaño. El alcohol bencílico actúa como disolvente y ligando al mismo tiempo permitiendo obtener directamente óxido de hierro desnudo calibrado sin necesidad de ligandos adicionales. Después de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo contó con el apoyo de la Unión Europea (proyecto ERC-2014-CoG MaTissE #648779). A los autores les gustaría reconocer la plataforma de caracterizaciones fisicoquímicas CNanoMat de la Universidad París 13.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Benzyl alcohol for synthesis | Sigma Aldrich | 8.22259 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare a 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C |
| Dichloromethane ≥99% stabilised, GPR RECTAPUR | VWR Chemicals | 23367 | |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| Hydrochloric acid, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35640 | |
| Iron(III) acetylacetonate (> 99.9%) | Sigma Aldrich | 517003 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare a fresh concentrated solution (25 mM) diluted in distilled water |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare a 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | |
| Monowave glass vial | Anton Paar | 82723_us | |
| Microwave reactor | Anton Paar | Monowave 300 | |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma Aldrich | 416010 | MW = 1200 g/mol |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Sodium hydroxide, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35629 | |
| Sodium pyruvate solution 100mM | Sigma | S8636 | |
| Sterile conical centrifuge tube | Falcon | 352097 | 15 mL tubes |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare a 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Tri-Sodium Citrate Dihydrate, Certified AR for Analysis | Sigma Aldrich | 10396430 | |
| Ultra centrifugal filter | Amicon | AC S510024 |
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