Utilisation de la magnétométrie pour surveiller l’incorporation cellulaire et la biodégradation subséquente des nanoparticules d’oxyde de fer synthétisées chimiquement

Summary

Les nanoparticules d’oxyde de fer sont synthétisées au moyen d’une procédure de gel sol nonaqueous et recouvertes de molécules courtes anioniques ou de polymère. L’utilisation de la magnétométrie pour surveiller l’incorporation et les biotransformations de nanoparticules magnétiques à l’intérieur des cellules souches humaines est démontrée à l’aide d’un magnétomètre d’échantillon vibrant (VSM).

Abstract

Les nanoparticules magnétiques, faites d’oxyde de fer, présentent un intérêt particulier pour un large éventail d’applications biomédicales pour lesquelles elles sont souvent intériorisées dans les cellules, puis laissées à l’intérieur. L’un des défis consiste à évaluer leur sort dans l’environnement intracellulaire avec des méthodologies fiables et précises. C’est pourquoi nous introduisons l’utilisation du magnétomètre d’échantillon vibrant (VSM) pour quantifier avec précision l’intégrité des nanoparticules magnétiques dans les cellules en mesurant leur moment magnétique. Les cellules souches sont d’abord étiquetées avec deux types de nanoparticules magnétiques; les nanoparticules ont le même noyau produit par une synthèse rapide et efficace de gel de sol nonaqueous à base de micro-ondes et diffèrent dans leur revêtement : la molécule d’acide citrique couramment utilisée est comparée à l’acide polyacrylique. La formation de sphéroïdes cellulaires 3D est ensuite obtenue par centrifugation et le moment magnétique de ces sphéroïdes est mesuré à différents moments avec le VSM. Le moment obtenu est une empreinte directe de l’intégrité des nanoparticules, avec des valeurs décroissantes indicatifs d’une dégradation des nanoparticules. Pour les deux nanoparticules, le moment magnétique diminue au fil du temps de culture révélant leur biodégradation. Un effet protecteur du revêtement acide polyacrylique est également montré, par rapport à l’acide citrique.

Introduction

Il y a un intérêt accru pour les caractéristiques magnétiques des nanoparticules d’oxyde de fer pour un large éventail d’applications biomédicales. Leur réponse à la résonance magnétique en fait des agents de contraste fiables pour l’imagerie par résonance magnétique (IRM), un avantage en médecine régénérative où les cellules étiquetées avec des nanoparticules magnétiques peuvent être suivies in vivo après l’implantation¹. À l’aide de champs magnétiques, les cellules peuvent également être guidées à distance; de cette façon, les sphéroïdes^{cellulaires 2,3},^{anneaux 4},^{ou feuilles 5} peuvent être conçus magnétiquement et aussi^{stimulés à distance 6}, un atout dans le développement de tissus sans échafaudage. L’éventail des possibilités pour ces nanoparticules comprend également les systèmes d’administration^{de médicaments 7,8 et} le traitement hyperthermal magnétique et photoinduced pour tuer les cellules cancéreuses^9,10,11. Pour toutes ces applications, les nanoparticules sont intégrées dans l’environnement biologique soit par injection intraveineuse, soit par internalisation directe dans les cellules, puis laissées à l’intérieur, ce qui remet en question leur destin intracellulaire.

Les analyses in vivo ont transmis une compréhension générale du sort des nanoparticules dans l’organisme : lors de l’injection dans le flux sanguin, elles sont d’abord capturées principalement par les macrophages du foie (cellules Kupffer), de la rate et de la moelle osseuse, sont progressivement dégradées, et rejoignent le pool de^{fer de l’organisme 12,13,14,15,16,17,18,19}. Les observations qualitatives ne sont possibles qu’en raison de la circulation des nanoparticules dans tout l’organisme. En règle générale, la microscopie électronique de transmission (TEM) peut être utilisée pour observer directement les nanoparticules et la présence de fer dans les organes peut être déterminée par dosage. Plus récemment, leur sort a été évalué directement sur un pool de cellules, ce qui signifie en circuit étroit sans fuite de fer, permettant une mesure quantitative de leurs biotransformations au niveau cellulaire^20,21,22. De telles mesures sont possibles grâce à l’analyse des propriétés magnétiques des nanoparticules étroitement liées à leur intégrité structurelle. La magnétométrie de l’échantillon vibrant (VSM) est une technique où l’échantillon vibre périodiquement de sorte que la mesure en bobine du flux induit fournit le moment magnétique de l’échantillon au champ magnétique appliqué. Une telle détection synchrone permet une mesure rapide, qui est un atout pour déterminer les moments magnétiques d’un grand nombre^{d’échantillons 20,21,22,23}. La signature magnétique macroscopique récupérée par VSM donne ensuite un aperçu quantitatif de l’ensemble de l’échantillon biologique directement corrélé à la taille et à la structure des nanoparticules. En particulier, il fournit le moment magnétique à saturation (exprimé en émeu) des échantillons, qui est une quantification directe du nombre de nanoparticules magnétiques présentes dans l’échantillon, respectivement à leurs propriétés magnétiques spécifiques.

Il a été démontré que le traitement intracellulaire des nanoparticules magnétiques est étroitement lié à leurs caractéristiques structurelles²⁰. Ces caractéristiques peuvent être contrôlées au moyen de protocoles de synthèse optimaux. Chaque protocole présente des avantages et des limites. Les nanoparticules d’oxyde de fer sont généralement synthétisées dans des solutions aqueuses par coprécipitation des ions fer^24. Pour surmonter les limites de la polydispersité de taille nanoparticules, d’autres méthodes de synthèse telles que les méthodes de sol-gel à base de polyol ont été^{développées 25}. Les approches nonaqueous par décomposition thermique mènent à la production des nanoparticules très bien calibrées d’oxyde de fer^26. Cependant, l’utilisation de quantités massives de surfactants comme l’oleylamine ou l’acide oléique complique leur fonctionnalisation et leur transfert d’eau pour des applications biomédicales. Pour cette raison, nous synthétisons ces nanoparticules magnétiques par une voie nonaqueous de gel de sol menant à la cristallinité élevée, à la pureté et à la^{reproductibilité 27.} Ce protocole produit des nanoparticules de taille bien contrôlées qui peuvent être réglées par variation de^{température 28}. Néanmoins, la voie sol-gel non aqueuse assistée par micro-ondes a une limite de taille supérieure des nanoparticules obtenues d’environ 12 nm. Cette procédure ne serait pas adaptée pour les applications utilisant des particules ferromagnétiques à température ambiante. En plus de la synthèse de base, une autre caractéristique principale à considérer est le revêtement. Situé à la surface de la nanoparticule, le revêtement agit comme une molécule d’ancrage, aidant à l’internalisation ciblée des nanoparticules, ou il peut protéger la nanoparticule contre la dégradation. Puisque l’alcool de benzyle agit comme source d’oxygène et ligand en même temps, les nanoparticules nues sont produites sans avoir besoin de surfactants ou de ligands supplémentaires. Les nanoparticules sont ensuite facilement fonctionnalisées à la surface après synthèse sans processus d’échange de surfactants.

Dans ce cas, deux types de nanoparticules sont évalués qui possèdent le même noyau et diffèrent dans le revêtement. Le noyau est synthétisé à l’aide d’une technique à base de micro-ondes rapide et très efficace. Les deux revêtements comparés se composent de l’acide citrique, l’un des plus utilisés comme agent de revêtement dans les applications biomédicales^29,30, et l’acide polyacrylique (PAA), un revêtement polymérique avec un grand nombre de fonctions de chélament. Les mesures de magnétométrie VSM sont ensuite utilisées d’abord pour quantifier l’absorption de nanoparticules par les cellules, puis comme une évaluation directe de l’intégrité structurale des nanoparticules lors de l’internalisation des cellules souches. Les résultats démontrent que la concentration d’incubation influe sur l’absorption des nanoparticules et que le revêtement influe sur leur dégradation, le grand nombre de molécules d’ancrage de l’AAP protégeant le noyau de la dégradation.

Protocol

1. Synthèse des nanoparticules magnétiques Synthèse de base – assistée par micro-ondes Dissoudre 400 mg d’acétytonate de fer (III) (>99.9%) dans 10 mL d’alcool de benzyle (BA, 99.8%) dans un flacon en verre mono ondes de 30 mL. Augmenter la température de la suspension de 25 à 250 °C en 20 min (à un taux de 11,25 °C/min) et la maintenir à 250 °C pendant 30 minutes à l’aide d’un réacteur à micro-ondes. Transférer les nanoparticules qui en résultent en susp…

Representative Results

À l’aide de la synthèse assistée par micro-ondes, des nanoparticules magnétiques d’une taille de noyau monodisperse de 8,8 ± de 2,5 nm sont produites et recouvertes de citrate ou de PAA (figure 1A). Les cellules souches sont ensuite incubées avec ces nanoparticules dispersées dans le milieu de la culture à une concentration donnée pendant 30 minutes, ce qui entraîne leur endocytose et leur confinement dans les endosomes cellulaires (figure 1B). Les…

Discussion

À l’aide d’une synthèse rapide et efficace à base de micro-ondes, les nanoparticules magnétiques peuvent facilement être synthétisées, de taille contrôlée, et enduites davantage de molécules données. Une étape critique consiste à stocker le sel de fer et l’alcool de benzyle sous vide pour garder une petite dispersion dans la taille. L’alcool de benzyle agit à la fois comme solvant et ligand en même temps permettant d’obtenir directement étalonné l’oxyde de fer nu sans avoir besoin de ligands …

Materials

0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies	25300-054
Benzyl alcohol for synthesis	Sigma Aldrich	8.22259
Dexamethasone	Sigma	D4902	Prepare a 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C
Dichloromethane ≥99% stabilised, GPR RECTAPUR	VWR Chemicals	23367
DMEM with Glutamax I	Life Technologies	31966-021	No sodium pyruvate, no HEPES
Ethanol absolute	VWR	20821.310
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10270-106
Formalin solution 10% neutral buffered	Sigma	HT5012
Hydrochloric acid, 1.0N Standardized Solution	Alfa Aesar	35640
Iron(III) acetylacetonate (> 99.9%)	Sigma Aldrich	517003
ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)	Corning	354352
L-Ascorbic Acid 2-phosphate	Sigma	A8960	Prepare a fresh concentrated solution (25 mM) diluted in distilled water
L-Proline	Sigma	P5607	Prepare a 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C
Mesenchymal Stem Cell (MSC)	Lonza	PT-2501
Monowave glass vial	Anton Paar	82723_us
Microwave reactor	Anton Paar	Monowave 300
MSCGM BulletKit medium	Lonza	PT-3001	For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium
PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2	Life Technologies	14190-094
Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL)	Life Technologies	15140-122
Poly(acrylic acid, sodium salt)	Sigma Aldrich	416010	MW = 1200 g/mol
RPMI medium 1640, no Glutamine	Life Technologies	31870-025	No sodium pyruvate, no HEPES
Sodium hydroxide, 1.0N Standardized Solution	Alfa Aesar	35629
Sodium pyruvate solution 100mM	Sigma	S8636
Sterile conical centrifuge tube	Falcon	352097	15 mL tubes
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300054
Tri-sodium citrate	VWR	33615.268	Prepare a 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C
Tri-Sodium Citrate Dihydrate, Certified AR for Analysis	Sigma Aldrich	10396430
Ultra centrifugal filter	Amicon	AC S510024