Magnetometrie gebruiken om cellulaire integratie en daaropvolgende biologische afbraak van chemisch gesynthetiseerde ijzeroxide nanodeeltjes te monitoren
Summary
IJzeroxide nanodeeltjes worden gesynthetiseerd via een nonaqueous sol gel procedure en bedekt met anionische korte moleculen of polymeer. Het gebruik van magnetometrie voor het monitoren van de integratie en biotransformaties van magnetische nanodeeltjes in menselijke stamcellen wordt aangetoond met behulp van een trillende monstermagnetometer (VSM).
Abstract
Magnetische nanodeeltjes, gemaakt van ijzeroxide, vormen een eigenaardige interesse voor een breed scala aan biomedische toepassingen waarvoor ze vaak in cellen worden geïnternaliseerd en vervolgens binnen worden gelaten. Een uitdaging is om hun lot in de intracellulaire omgeving te beoordelen met betrouwbare en nauwkeurige methodologieën. Hierin introduceren we het gebruik van de vibrerende monstermagnetometer (VSM) om de integriteit van magnetische nanodeeltjes in cellen nauwkeurig te kwantificeren door hun magnetische moment te meten. Stamcellen worden eerst geëtiketteerd met twee soorten magnetische nanodeeltjes; de nanodeeltjes hebben dezelfde kern geproduceerd via een snelle en efficiënte nonaqueous sol gel synthese in de magnetron en verschillen in hun coating: het veelgebruikte citroenzuurmolecuul wordt vergeleken met polyacrylzuur. De vorming van 3D-cel-sferoïden wordt vervolgens bereikt via centrifugatie en het magnetische moment van deze sferoïden wordt op verschillende tijdstippen gemeten met de VSM. Het verkregen moment is een directe vingerafdruk van de integriteit van de nanodeeltjes, met afnemende waarden die wijzen op een afbraak van nanodeeltjes. Voor beide nanodeeltjes neemt het magnetische moment in de loop van de cultuurtijd af en onthult hun biologische afbraak. Een beschermend effect van de polyacrylzuurcoating wordt ook getoond, in vergelijking met citroenzuur.
Introduction
Er is een toegenomen interesse in de magnetische kenmerken van ijzeroxide nanodeeltjes voor een breed scala aan biomedische toepassingen. Hun reactie op magnetische resonantie maakt ze betrouwbare contrastmiddelen voor magnetische resonantie beeldvorming (MRI), een voordeel in de regeneratieve geneeskunde waar cellen met het label magnetische nanodeeltjes kunnen worden gevolgd in vivo na implantatie1. Met behulp van magnetische velden kunnen cellen ook op afstand worden geleid; op deze manier kunnen cellulaire sferoïden2,3,ringen 4ofvellen 5 magnetisch worden ontworpen en ook op afstand worden gestimuleerd6, een aanwinst in de ontwikkeling van steigervrije weefsels. Het scala aan mogelijkheden voor deze nanodeeltjes omvat ook toedieningssystemen voor geneesmiddelen7,8 en magnetische en foto-geïnduceerde hyperthermische behandeling om kankercellen te doden9,10,11. Voor al deze toepassingen worden de nanodeeltjes geïntegreerd in de biologische omgeving, hetzij door intraveneuze injectie, hetzij door directe internalisatie in cellen en worden ze vervolgens binnengelaten, wat hun intracellulaire lot in twijfel brengt.
In vivo analyses brachten een algemeen begrip van het lot van de nanodeeltjes in het organisme over: bij injectie in de bloedstroom worden ze voor het eerst meestal gevangen door de macrofagen van de lever (Kupffer-cellen), milt en beenmerg, geleidelijk afgebroken en sluiten ze zich aan bij de ijzeren pool van het organisme12,13,14,15,16,17,18,19. Kwalitatieve waarnemingen zijn alleen mogelijk vanwege de circulatie van de nanodeeltjes in het hele organisme. Meestal kan transmissie elektronische microscopie (TEM) worden gebruikt om de nanodeeltjes direct te observeren en kan de aanwezigheid van ijzer in de organen worden bepaald via de dosering. Meer recentelijk is hun lot rechtstreeks beoordeeld op een pool van cellen, wat betekent dat ze in een nauw circuit zonder ijzeren ontsnapping, waardoor een kwantitatieve meting van hun biotransformaties op celniveau20,21,22mogelijk is . Dergelijke metingen zijn mogelijk door de analyse van de magnetische eigenschappen van de nanodeeltjes die nauw verbonden zijn met hun structurele integriteit. Vibrerende monstermagnetometrie (VSM) is een techniek waarbij het monster periodiek wordt getrild, zodat de spoelmeting van de geïnduceerde flux het magnetische moment van het monster op het toegepaste magnetische veld biedt. Een dergelijke synchrone detectie maakt een snelle meting mogelijk , wat een aanwinst is voor het bepalen van de magnetische momenten van een groot aantal monsters20,21,22,23. De macroscopische magnetische signatuur die door VSM wordt opgehaald, geeft vervolgens een kwantitatief overzicht van het volledige biologische monster dat rechtstreeks is gecorreleerd met de grootte en structuur van de nanodeeltjes. Het biedt met name het magnetische moment bij verzadiging (uitgedrukt in emu) van de monsters, wat een directe kwantificering is van het aantal magnetische nanodeeltjes dat in het monster aanwezig is, respectievelijk aan hun specifieke magnetische eigenschappen.
Het is aangetoond dat de intracellulaire verwerking van magnetische nanodeeltjes nauw verbonden is met hun structurele kenmerken20. Deze functies kunnen worden bestuurd via optimale syntheseprotocollen. Elk protocol biedt voordelen en beperkingen. IJzeroxide nanodeeltjes worden gewoonlijk gesynthetiseerd in waterige oplossingen via coprecipatie van ijzerionen24. Om de beperkingen van polydispersiteit van nanodeeltjesgrootte te overwinnen, zijn andere synthesemethoden ontwikkeld, zoals polyolgemedieerde sol-gel-methoden25. Nonaqueous benaderingen door thermische ontbinding leidt tot de productie van zeer goed gekalibreerde ijzeroxide nanodeeltjes26. Het gebruik van enorme hoeveelheden oppervlakteactieve stoffen zoals oleylamine of oliezuur bemoeilijkt echter hun functionalisatie en wateroverdracht voor biomedische toepassingen. Om deze reden synthetiseren we dergelijke magnetische nanodeeltjes via een nonaqueous sol gel-route die leidt tot een hoge kristalliniteit, zuiverheid en reproduceerbaarheid27. Dit protocol produceert goed gecontroleerde grootte nanodeeltjes die kunnen worden afgestemd door middel van temperatuurvariatie28. Niettemin heeft de niet-waterige sol-gelroute in de magnetron een bovengrens van de verkregen nanodeeltjes van ongeveer 12 nm. Deze procedure zou niet worden aangepast voor toepassingen met ferromagnetische deeltjes bij kamertemperatuur. Naast de kernsynthese is een ander belangrijk kenmerk dat in overweging moet worden genomen de coating. Liggend aan het oppervlak van het nanodeeltje fungeert de coating als een verankeringsmolecuul, dat de gerichte internalisatie van de nanodeeltjes helpt, of het kan het nanodeeltje beschermen tegen afbraak. Omdat benzylalcohol tegelijkertijd als zuurstofbron en ligand fungeert, worden kale nanodeeltjes geproduceerd zonder dat er extra oppervlakteactieve stoffen of liganden nodig zijn. De nanodeeltjes worden dan gemakkelijk gefunctionaliseerd na synthese zonder een oppervlakteactieve uitwisselingsproces.
Hierin worden twee soorten nanodeeltjes beoordeeld die dezelfde kern bezitten en verschillen in de coating. De kern wordt gesynthetiseerd met behulp van een snelle en zeer efficiënte techniek op basis van de magnetron. De twee vergeleken coatings bestaan uit citroenzuur, een van de meest gebruikte als coatingmiddel in biomedische toepassingen29,30, en polyacrylzuur (PAA), een polymere coating met een groot aantal chelaatfuncties. VSM-magnetometriemetingen worden vervolgens eerst gebruikt om de opname van nanodeeltjes door de cellen te kwantificeren en vervolgens als een directe beoordeling van de structurele integriteit van het nanodeeltje bij internalisatie in stamcellen. De resultaten tonen aan dat de incubatieconcentratie van invloed is op de opname van nanodeeltjes en dat de coating hun afbraak beïnvloedt, waarbij het grote aantal verankeringsmoleculen van PAA de kern beschermt tegen afbraak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met behulp van een snelle en efficiënte microgolfsynthese kunnen magnetische nanodeeltjes gemakkelijk worden gesynthetiseerd, met gecontroleerde grootte en verder worden bedekt met bepaalde moleculen. Een cruciale stap is om het ijzerzout en de benzylalcohol onder vacuüm op te slaan om een kleine dispersie in grootte te houden. De benzylalcohol werkt zowel als oplosmiddel als ligand en maakt het mogelijk om direct gekalibreerd kaal ijzeroxide te verkrijgen zonder dat er extra liganden nodig zijn. Na de overdracht van n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Europese Unie (ERC-2014-CoG project MaTissE #648779). De auteurs willen graag het CNanoMat fysisch-chemische karakteriseringsplatform van University Paris 13 erkennen.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Benzyl alcohol for synthesis | Sigma Aldrich | 8.22259 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare a 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C |
| Dichloromethane ≥99% stabilised, GPR RECTAPUR | VWR Chemicals | 23367 | |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| Hydrochloric acid, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35640 | |
| Iron(III) acetylacetonate (> 99.9%) | Sigma Aldrich | 517003 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare a fresh concentrated solution (25 mM) diluted in distilled water |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare a 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | |
| Monowave glass vial | Anton Paar | 82723_us | |
| Microwave reactor | Anton Paar | Monowave 300 | |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma Aldrich | 416010 | MW = 1200 g/mol |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Sodium hydroxide, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35629 | |
| Sodium pyruvate solution 100mM | Sigma | S8636 | |
| Sterile conical centrifuge tube | Falcon | 352097 | 15 mL tubes |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare a 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Tri-Sodium Citrate Dihydrate, Certified AR for Analysis | Sigma Aldrich | 10396430 | |
| Ultra centrifugal filter | Amicon | AC S510024 |
References
- Azevedo-Pereira, R. L., et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles as a tool to track mouse neural stem cells in vivo. Molecular Biology Reports. 46 (1), 191-198 (2019).
- Fayol, D., Frasca, G., Le Visage, C., Gazeau, F., Luciani, N., Wilhelm, C. Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling. Advanced Materials. 25 (18), 2611-2616 (2013).
- Kim, J. A., et al. High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture. Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).
- Yamamoto, Y., et al. Preparation of artificial skeletal muscle tissues by a magnetic force-based tissue engineering technique. Journal of Bioscience and Bioengineering. 108 (6), 538-543 (2009).
- Gonçalves, A. I., Rodrigues, M. T., Gomes, M. E. Tissue-engineered magnetic cell sheet patches for advanced strategies in tendon regeneration. Acta Biomaterialia. 63, 110-122 (2017).
- Du, V., et al. A 3D magnetic tissue stretcher for remote mechanical control of embryonic stem cell differentiation. Nature Communications. 8 (1), 400 (2017).
- Amiri, M., Salavati-Niasari, M., Pardakhty, A., Ahmadi, M., Akbari, A. Caffeine: A novel green precursor for synthesis of magnetic CoFe2O4 nanoparticles and pH-sensitive magnetic alginate beads for drug delivery. Materials Science and Engineering: C. 76, 1085-1093 (2017).
- Vangijzegem, T., Stanicki, D., Laurent, S. Magnetic iron oxide nanoparticles for drug delivery: applications and characteristics. Expert Opinion on Drug Delivery. 16 (1), 69-78 (2019).
- Cazares-Cortes, E., et al. Recent insights in magnetic hyperthermia: From the “hot-spot” effect for local delivery to combined magneto-photo-thermia using magneto-plasmonic hybrids. Advanced Drug Delivery Reviews. 138, 233-246 (2019).
- Espinosa, A., et al. Magnetic (Hyper)Thermia or Photothermia? Progressive Comparison of Iron Oxide and Gold Nanoparticles Heating in Water, in Cells, and in vivo. Advanced Functional Materials. 28 (37), 1803660 (2018).
- Plan Sangnier, A., et al. Targeted thermal therapy with genetically engineered magnetite magnetosomes@RGD: Photothermia is far more efficient than magnetic hyperthermia. Journal of Controlled Release. 279, 271-281 (2018).
- Pham, B. T. T., et al. Biodistribution and Clearance of Stable Superparamagnetic Maghemite Iron Oxide Nanoparticles in Mice Following Intraperitoneal Administration. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).
- Kolosnjaj-Tabi, J., et al. Biotransformations of magnetic nanoparticles in the body. Nano Today. 11 (3), 280-284 (2016).
- Bargheer, D., et al. The distribution and degradation of radiolabeled superparamagnetic iron oxide nanoparticles and quantum dots in mice. Beilstein Journal of Nanotechnology. 6, 111-123 (2015).
- Freund, B., et al. A simple and widely applicable method to 59Fe-radiolabel monodisperse superparamagnetic iron oxide nanoparticles for in vivo quantification studies. ACS Nano. 6 (8), 7318-7325 (2012).
- Singh, S. P., Rahman, M. F., Murty, U. S. N., Mahboob, M., Grover, P. Comparative study of genotoxicity and tissue distribution of nano and micron sized iron oxide in rats after acute oral treatment. Toxicology and Applied Pharmacology. 266 (1), 56-66 (2013).
- Levy, M., et al. Long term in vivo biotransformation of iron oxide nanoparticles. Biomaterials. 32 (16), 3988-3999 (2011).
- Briley-Saebo, K., et al. Hepatic cellular distribution and degradation of iron oxide nanoparticles following single intravenous injection in rats: implications for magnetic resonance imaging. Cell and Tissue Research. 316 (3), 315-323 (2004).
- Gu, L., Fang, R. H., Sailor, M. J., Park, J. H. In vivo Clearance and Toxicity of Monodisperse Iron Oxide Nanocrystals. ACS Nano. 6 (6), 4947-4954 (2012).
- Sangnier, A. P., et al. Impact of magnetic nanoparticle surface coating on their long-term intracellular biodegradation in stem cells. Nanoscale. , (2019).
- Mazuel, F., et al. Magneto-Thermal Metrics Can Mirror the Long-Term Intracellular Fate of Magneto-Plasmonic Nanohybrids and Reveal the Remarkable Shielding Effect of Gold. Advanced Functional Materials. 27 (9), 1605997 (2017).
- Van de Walle, A., et al. Biosynthesis of magnetic nanoparticles from nano-degradation products revealed in human stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4044-4053 (2019).
- Mazuel, F., et al. Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels. ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).
- Bee, A., Massart, R., Neveu, S. Synthesis of very fine maghemite particles. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 149 (1), 6-9 (1995).
- Feldmann, C., Jungk, H. O. Polyol-Mediated Preparation of Nanoscale Oxide Particles. Angewandte Chemie International Edition. 40 (2), 359-362 (2001).
- Hyeon, T., Lee, S. S., Park, J., Chung, Y., Na, H. B. Synthesis of Highly Crystalline and Monodisperse Maghemite Nanocrystallites without a Size-Selection Process. Journal of the American Chemical Society. 123 (51), 12798-12801 (2001).
- Pinna, N., Grancharov, S., Beato, P., Bonville, P., Antonietti, M., Niederberger, M. Magnetite Nanocrystals: Nonaqueous Synthesis, Characterization, and Solubility. Chemistry of Materials. 17 (11), 3044-3049 (2005).
- Richard, S., et al. USPIO size control through microwave nonaqueous sol-gel method for neoangiogenesis T2 MRI contrast agent. Nanomedicine. 11 (21), 2769-2797 (2016).
- Ngo, A. T., Pileni, M. P. Assemblies of Ferrite Nanocrystals: Partial Orientation of the Easy Magnetic Axes. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (1), 53-58 (2001).
- Li, L., et al. Effect of synthesis conditions on the properties of citric-acid coated iron oxide nanoparticles. Microelectronic Engineering. 110, 329-334 (2013).
- Sun, X., et al. Tracking stem cells and macrophages with gold and iron oxide nanoparticles – The choice of the best suited particles. Applied Materials Today. 15, 267-279 (2019).
- Buchner, M., Höfler, K., Henne, B., Ney, V., Ney, A. Tutorial: Basic principles, limits of detection, and pitfalls of highly sensitive SQUID magnetometry for nanomagnetism and spintronics. Journal of Applied Physics. 124 (16), 161101 (2018).
- Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells. European Biophysics Journal. 31 (2), 118-125 (2002).
- Jing, Y., et al. Quantitative intracellular magnetic nanoparticle uptake measured by live cell magnetophoresis. The FASEB Journal. 22 (12), 4239-4247 (2008).
- Van de Walle, A., et al. Real-time in situ magnetic measurement of the intracellular biodegradation of iron oxide nanoparticles in a stem cell-spheroid tissue model. Nano Research. , (2020).
