磁気測定を用いて細胞の組み込みとそれに続く化学的合成酸化鉄ナノ粒子の生分解をモニタリングする
Summary
酸化鉄ナノ粒子は、非水性ゾルゲル法を介して合成され、アニオン性短分子またはポリマーでコーティングされる。ヒト幹細胞内部の磁気ナノ粒子の組み込みや生体変換をモニタリングするための磁気測定の使用は、振動試料磁力計(VSM)を用いて実証されています。
Abstract
酸化鉄で作られた磁性ナノ粒子は、細胞内にしばしば内在し、その後内部に残される生物医学的用途の広い範囲に独特の関心を提示する。1つの課題は、信頼性の高い正確な方法論で細胞内環境における彼らの運命を評価することです。ここでは、振動サンプル磁力計(VSM)を用いて、磁気モーメントを測定することで、細胞内の磁性ナノ粒子の完全性を正確に定量化する。幹細胞は、まず2種類の磁性ナノ粒子で標識されます。ナノ粒子は、迅速かつ効率的なマイクロ波ベースの非水溶液ゾルゲル合成を介して生成される同じコアを有し、そのコーティングにおいて異なる:一般的に使用されるクエン酸分子は、ポリアクリル酸と比較される。3Dセルスフェロイドの形成は遠心分離によって達成され、これらの回転楕円体の磁気モーメントはVSMと異なる時間に測定される。得られた瞬間は、ナノ粒子の完全性の直接の指紋であり、ナノ粒子の分解を示す値が減少する。両方のナノ粒子について、磁気モーメントは培養時間の経過とともに減少し、その生分解を明らかにする。クエン酸と比較した場合、ポリアクリル酸コーティングの保護効果も示される。
Introduction
広範囲の生物医学用途に対する酸化鉄ナノ粒子の磁気的特徴に対する関心が高まっている。磁気共鳴に対する応答は、磁気共鳴画像法(MRI)の信頼性の高い造影剤を作り、磁気ナノ粒子で標識された細胞を移植1後に生体内で追跡できる再生医療における利点である。磁場を使用すると、距離でセルを誘導することもできます。このように、セルラーススフェロイド2、3、リング4、またはシート5は、磁気的に設計され、また足場のない組織の開発における資産である6を遠隔刺激することができる。これらのナノ粒子の可能性の範囲はまた、薬物送達システム7、8および癌細胞9、10、11を殺すために磁気および光誘導性高熱治療を含む。これらすべての用途に対して、ナノ粒子は、静脈内注射または細胞内の直接の内在化によって生物学的環境に統合され、その後、その中に残され、細胞内の運命に疑問をもたらします。
生体内分析は、生体内のナノ粒子の運命の一般的な理解を伝えた:血流中の注入時に、それらは最初に肝臓(クファー細胞)、脾臓および骨髄のマクロファージによって主に捕捉され、徐々に分解され、生物12、13、14、15、16、17、18、18の鉄プールに結合する。定性的な観察は、生物全体のナノ粒子の循環のためにのみ可能です。典型的には、透過電子顕微鏡(TEM)を使用して、ナノ粒子を直接観察することができ、器官中の鉄の存在は、投与量を介して決定することができる。最近では、それらの運命は細胞のプールで直接評価されており、鉄分けのない近い回路では、細胞レベル20、21、22での生体変換の定量的測定が可能である。このような測定は、構造の完全性に密接に関連しているナノ粒子の磁気特性の分析によって可能である。振動サンプル磁気測定(VSM)は、誘導されたフラックスのコイル測定が適用された磁場でのサンプルの磁気モーメントを提供するようにサンプルを周期的に振動させる技術です。このような同期検出は、多数のサンプル20、21、22、23の磁気モーメントを決定するための資産である迅速な測定を可能にする。VSMによって得られた巨視的磁気シグネチャは、ナノ粒子のサイズと構造に直接相関する生物学的サンプル全体の定量的な概要を与える。特に、サンプルの飽和時の磁気モーメント(emuで表す)を提供し、これはサンプル中に存在する磁気ナノ粒子の数をそれぞれ特異的な磁気特性に直接定量するものである。
磁気ナノ粒子の細胞内処理は、その構造特徴20と密接に結びついていることが示されている。これらの機能は、最適な合成プロトコルを介して制御することができます。各プロトコルには利点と制限があります。酸化鉄ナノ粒子は、一般的に、鉄イオン24の共沈を介して水溶液中で合成される。ナノ粒子サイズの多分散性の限界を克服するために、ポリオール媒介ゾルゲル法などの他の合成方法が25に開発されている。熱分解による非水性アプローチは、非常によく較正された酸化鉄ナノ粒子26の製造につながる。しかし、オレイラミンやオレイン酸のような大量の界面活性剤を使用すると、生物医学の用途のために機能化と水の移動が複雑になります。このため、このような磁性ナノ粒子を、高い結晶性、純度、再現性27に至る非水性ゾルゲル経路を介して合成する。このプロトコルは、温度変動28によって調整することができる十分に制御されたサイズのナノ粒子を生成する。それにもかかわらず、マイクロ波支援非水性ゾルゲル経路は、12nm前後の得られたナノ粒子の上限サイズ制限を有する。この手順は、室温で強磁性粒子を使用するアプリケーションには適合しません。コア合成に加えて、検討されるもう一つの主な特徴はコーティングである。ナノ粒子の表面に横たわって、コーティングはアンカー分子として機能し、ナノ粒子の標的化された内在化を助ける、またはナノ粒子を分解から保護することができる。ベンジルアルコールは酸素源とリガンドとして同時に作用するため、追加の界面活性剤やリガンドを必要とせずに裸ナノ粒子が生成されます。ナノ粒子は、界面活性剤交換プロセスなしで合成後に容易に機能する表面化される。
本明細書において、2種類のナノ粒子が同じコアを有し、コーティングにおいて異なると評価される。コアは高速かつ高効率のマイクロ波ベースの技術を使用して合成されます。比較した2つのコーティングは、バイオメディカルアプリケーションで最も使用されるクエン酸、29、30、およびポリアクリル酸(PAA)、キレート機能の高いポリマーコーティングで構成されています。VSM磁気測定は、まず細胞のナノ粒子取り込みの定量を行い、次に幹細胞内在化時のナノ粒子構造の完全性を直接評価するために使用されます。結果は、インキュベーション濃度がナノ粒子の取り込みに影響を与え、コーティングが劣化に影響を与えることを示し、PAAのアンカー分子の数が多く、コアを劣化から保護する。
Protocol
Representative Results
Discussion
高速かつ効率的なマイクロ波ベースの合成を使用して、磁気ナノ粒子は、制御されたサイズで、容易に合成することができ、さらに与えられた分子でコーティングされています。重要なステップは、鉄塩とベンジルアルコールを真空下でストックし、小さな分散液を小さく保つことです。ベンジルアルコールは溶媒とリガンドの両方として作用すると同時に、追加のリガンドを必要とせずに?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、欧州連合(EU)(ERC-2014-CoGプロジェクトMaTissE#648779によってサポートされました)。著者らは、パリ大学13のCNanoMat物理化学的特徴付けプラットフォームを認めたいと考えています。
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Benzyl alcohol for synthesis | Sigma Aldrich | 8.22259 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare a 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C |
| Dichloromethane ≥99% stabilised, GPR RECTAPUR | VWR Chemicals | 23367 | |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| Hydrochloric acid, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35640 | |
| Iron(III) acetylacetonate (> 99.9%) | Sigma Aldrich | 517003 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare a fresh concentrated solution (25 mM) diluted in distilled water |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare a 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | |
| Monowave glass vial | Anton Paar | 82723_us | |
| Microwave reactor | Anton Paar | Monowave 300 | |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma Aldrich | 416010 | MW = 1200 g/mol |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Sodium hydroxide, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35629 | |
| Sodium pyruvate solution 100mM | Sigma | S8636 | |
| Sterile conical centrifuge tube | Falcon | 352097 | 15 mL tubes |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare a 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Tri-Sodium Citrate Dihydrate, Certified AR for Analysis | Sigma Aldrich | 10396430 | |
| Ultra centrifugal filter | Amicon | AC S510024 |
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