सेलुलर निगमन और रासायनिक संश्लेषित आयरन ऑक्साइड नैनोकणों के बाद बायोडिग्रेडेशन की निगरानी करने के लिए मैग्नेटोमेट्री का उपयोग करना
Summary
आयरन ऑक्साइड नैनोकणों को एक नोनेकस सोल जेल प्रक्रिया के माध्यम से संश्लेषित किया जाता है और एनियोनिक छोटे अणुओं या बहुलक के साथ लेपित किया जाता है। मानव स्टेम कोशिकाओं के अंदर चुंबकीय नैनोकणों के समावेश और जैव संचार की निगरानी के लिए मैग्नेटोमेट्री का उपयोग एक कंपन नमूना मैग्नेटोमीटर (वीएसएम) का उपयोग करके प्रदर्शित किया जाता है।
Abstract
चुंबकीय नैनोकणों, लोहे के ऑक्साइड से बना है, जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए एक अजीब रुचि पेश करते हैं जिसके लिए वे अक्सर कोशिकाओं में आंतरिक होते हैं और फिर भीतर छोड़ दिया जाता है। एक चुनौती विश्वसनीय और सटीक तरीकों के साथ इंट्रासेलुलर वातावरण में उनके भाग्य का आकलन करना है। इसके साथ ही, हम अपने चुंबकीय क्षण को मापने के द्वारा कोशिकाओं के भीतर चुंबकीय नैनोकणों की अखंडता को ठीक से निर्धारित करने के लिए कंपन नमूना मैग्नेटोमीटर (वीएसएम) के उपयोग का परिचय देते हैं। स्टेम सेल पहले चुंबकीय नैनोकणों के दो प्रकार के साथ लेबल कर रहे हैं; नैनोकणों में एक ही कोर होता है जो एक तेज और कुशल माइक्रोवेव-आधारित नोनेकस सोल जेल संश्लेषण के माध्यम से उत्पादित होता है और उनके कोटिंग में भिन्न होता है: आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले साइट्रिक एसिड अणु की तुलना पॉलीएक्रिलिक एसिड से की जाती है। 3 डी सेल-स्फेरॉइड का गठन तब अपकेंद्रित्र के माध्यम से प्राप्त किया जाता है और इन स्फेरॉइड के चुंबकीय क्षण को वीएसएम के साथ अलग-अलग समय पर मापा जाता है। प्राप्त क्षण नैनोकणों की अखंडता का एक सीधा फिंगरप्रिंट है, जिसमें नैनोकण क्षरण का संकेत मूल्य घटते हैं । दोनों नैनोकणों के लिए, चुंबकीय क्षण संस्कृति समय पर कम हो जाती है उनके बायोडिग्रेडेशन का खुलासा । साइट्रिक एसिड की तुलना में पॉलीएक्रिलिक एसिड कोटिंग का सुरक्षात्मक प्रभाव भी दिखाया गया है।
Introduction
बायोमेडिकल अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए आयरन ऑक्साइड नैनोकणों की चुंबकीय विशेषताओं में रुचि बढ़ी है। चुंबकीय अनुनाद के प्रति उनकी प्रतिक्रिया उन्हें चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) के लिए विश्वसनीय विपरीत एजेंट बनाती है, जो पुनर्योजी दवा में एक लाभ है जहां चुंबकीय नैनोकणों के साथ लेबल की कोशिकाओं को प्रत्यारोपण के बाद वीवो में ट्रैक किया जा सकता है1। चुंबकीय क्षेत्रों का उपयोग करना, कोशिकाओं को भी एक दूरी पर निर्देशित किया जा सकता है; इस तरह, सेलुलर गोलाकार2,3,छल्ले 4,या चादरें5 चुंबकीय रूप से इंजीनियर किया जा सकता है और यह भी दूर से6,पाड़ मुक्त ऊतकों के विकास में एक परिसंपत्ति उत्तेजित । इन नैनोकणों के लिए संभावनाओं की सीमा में कैंसर कोशिकाओं को मारने के लिए दवा वितरण प्रणाली7,8 और चुंबकीय और फोटो प्रेरित हाइपरथर्मल उपचार भी शामिल है9,10,11. इन सभी अनुप्रयोगों के लिए, नैनोकणों को जैविक वातावरण में या तो नसों में इंजेक्शन द्वारा या कोशिकाओं में प्रत्यक्ष आंतरिककरण के माध्यम से एकीकृत किया जाता है और फिर भीतर छोड़ दिया जाता है, जो उनके इंट्रासेलुलर भाग्य को प्रश्न में लाता है।
वीवो विश्लेषणों में जीव में नैनोकणों के भाग्य की सामान्य समझ व्यक्त की गई: रक्त प्रवाह में इंजेक्शन पर, उन्हें पहले ज्यादातर यकृत (कुफर कोशिकाओं), तिल्ली और बोन मैरो के मैक्रोफेज द्वारा पकड़ा जाता है, उत्तरोत्तर अपमानित किया जाता है,और जीव12, 13,14, 15,16,17,18,19के लोहे के पूल में शामिल होते हैं। गुणात्मक अवलोकन केवल पूरे जीव में नैनोकणों के परिसंचरण के कारण संभव हैं। आमतौर पर, ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी (TEM) का उपयोग नैनोकणों का सीधे निरीक्षण करने के लिए किया जा सकता है और अंगों में लोहे की उपस्थिति खुराक के माध्यम से निर्धारित की जा सकती है। हाल ही में, उनके भाग्य का मूल्यांकन सीधे कोशिकाओं के एक पूल पर किया गया है, जिसका अर्थ है लोहे से बचने के साथ क्लोज सर्किट में, सेल स्तर20, 21,22पर उनके जैव संचार की मात्रात्मक माप कीअनुमति। इस तरह के माप नैनोकणों के चुंबकीय गुणों के विश्लेषण के माध्यम से संभव हैं जो उनकी संरचनात्मक अखंडता से कसकर जुड़े हुए हैं। कंपन नमूना मैग्नेटोमेट्री (वीएसएम) एक तकनीक है जहां नमूना समय-समय पर कंपन किया जाता है ताकि प्रेरित फ्लक्स का कुंडल-माप लागू चुंबकीय क्षेत्र में नमूने का चुंबकीय क्षण प्रदान करता है। इस तरह का समकालिक पता लगाने से तेजी से मापन की अनुमति होती है, जो बड़ी संख्या में नमूनों के चुंबकीयक्षणों 20, 21,22,23के चुंबकीयक्षणोंको निर्धारित करने के लिए एक परिसंपत्ति है। वीएसएम द्वारा प्राप्त स्थूल चुंबकीय हस्ताक्षर तब नैनोकणों के आकार और संरचना से सीधे सहसंबद्ध पूरे जैविक नमूने का मात्रात्मक अवलोकन देता है। विशेष रूप से, यह नमूनों के संतृप्ति (ईमू में व्यक्त) पर चुंबकीय क्षण प्रदान करता है, जो नमूने में मौजूद चुंबकीय नैनोकणों की संख्या का प्रत्यक्ष मात्राकरण है, क्रमशः उनके विशिष्ट चुंबकीय गुणों के लिए ।
यह दर्शाया गया है कि चुंबकीय नैनोकणों का इंट्रासेलुलर प्रसंस्करण उनकी संरचनात्मकविशेषताओंसे कसकर जुड़ा हुआ है । इन सुविधाओं को इष्टतम संश्लेषण प्रोटोकॉल के माध्यम से नियंत्रित किया जा सकता है। प्रत्येक प्रोटोकॉल फायदे और सीमाएं प्रस्तुत करता है। आयरन ऑक्साइड नैनोकणों को आमतौर पर जलीय समाधानों में संश्लेषित किया जाताहै। नैनोकणों के आकार की बहुविषय की सीमाओं को दूर करने के लिए, पॉलीओल-मध्यस्थता वाले सोल-जेल विधियों जैसे अन्य संश्लेषण विधियों को25विकसित किया गया है। थर्मल अपघटन के कारण ननकीय दृष्टिकोणों से बहुत अच्छी तरह से कैलिब्रेटेड आयरन ऑक्साइड नैनोकणों का उत्पादन होता है26. हालांकि, ओलियामाइन या ओलिक एसिड जैसे सर्फेक्टेंट की भारी मात्रा का उपयोग जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए उनके कार्यात्मकीकरण और पानी के हस्तांतरण को जटिल बना देता है। इस कारण से, हम ऐसे चुंबकीय नैनोकणों को एक नोनेकस सोल जेल मार्ग के माध्यम से संश्लेषित करते हैं जिससे उच्च क्रिस्टलीयता, शुद्धता और प्रजननक्षमता 27हो जाती है। यह प्रोटोकॉल अच्छी तरह से नियंत्रित आकार के नैनोकणों का उत्पादन करता है जिन्हें तापमान भिन्नता28के माध्यम से ट्यून किया जा सकता है। फिर भी, माइक्रोवेव-असिस्टेड गैर-जलीय सोल-जेल मार्ग में लगभग 12 एनएम के प्राप्त नैनोकणों की ऊपरी आकार सीमा है। इस प्रक्रिया को कमरे के तापमान पर फेरोमैग्नेटिक कणों का उपयोग करके अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित नहीं किया जाएगा। कोर संश्लेषण के अलावा, एक और मुख्य विशेषता पर विचार किया जाना कोटिंग है। नैनोकण की सतह पर झूठ बोलना, कोटिंग एक प्रस्तोता अणु के रूप में कार्य करता है, नैनोकणों के लक्षित आंतरिककरण में मदद करता है, या यह नैनोकण को गिरावट से बचा सकता है। चूंकि बेंजाइल अल्कोहल एक ऑक्सीजन स्रोत और एक ही समय में एक लिगामेंट के रूप में कार्य करता है, इसलिए अतिरिक्त सर्फेक्टेंट या लिगामेंट्स की आवश्यकता के बिना नंगे नैनोकणों का उत्पादन किया जाता है। नैनोकणों को बिना किसी सर्फेक्टेंट विनिमय प्रक्रिया के संश्लेषण के बाद आसानी से सतह पर ले जाया जाता है।
इसके साथ ही, दो प्रकार के नैनोकणों का आकलन किया जाता है जो एक ही कोर के अधिकारी होते हैं और कोटिंग में भिन्न होते हैं। कोर एक तेज और अत्यधिक कुशल माइक्रोवेव आधारित तकनीक का उपयोग कर संश्लेषित किया जाता है। दो कोटिंग्स की तुलना में साइट्रिक एसिड, जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों29,30,और पॉलीएक्रिलिक एसिड (पीए) में कोटिंग एजेंट के रूप में सबसे अधिक इस्तेमाल किया, एक उच्च संख्या में चेलिंग कार्यों के साथ एक पॉलीमेरिक कोटिंग से मिलकर बनता है । वीएसएम मैग्नेटोमेट्री माप का उपयोग पहले कोशिकाओं द्वारा नैनोपार्टिकल तेज को निर्धारित करने के लिए किया जाता है, और फिर स्टेम कोशिकाओं में आंतरिककरण पर नैनोपार्टिकल संरचनात्मक अखंडता के प्रत्यक्ष आकलन के रूप में। परिणाम दर्शाते हैं कि इनक्यूबेशन एकाग्रता नैनोपार्टिकल तेज को प्रभावित करती है और कोटिंग उनके क्षरण को प्रभावित करती है, जिसमें पीए के एंकरिंग अणुओं की बड़ी संख्या में कोर को गिरावट से बचाती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक तेज और कुशल माइक्रोवेव आधारित संश्लेषण का उपयोग करके, चुंबकीय नैनोकणों को आसानी से संश्लेषित किया जा सकता है, नियंत्रित आकार के साथ, और आगे दिए गए अणुओं के साथ लेपित किया जा सकता है। एक महत्वपूर्ण कद?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को यूरोपियन यूनियन (ईआरसी-2014-सीओजी प्रोजेक्ट MaTissE #648779) ने सपोर्ट किया । लेखक यूनिवर्सिटी पेरिस 13 के CNanoMat फिजियो-केमिकल लक्षण मंच को स्वीकार करना चाहते हैं।
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Benzyl alcohol for synthesis | Sigma Aldrich | 8.22259 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare a 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C |
| Dichloromethane ≥99% stabilised, GPR RECTAPUR | VWR Chemicals | 23367 | |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| Hydrochloric acid, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35640 | |
| Iron(III) acetylacetonate (> 99.9%) | Sigma Aldrich | 517003 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare a fresh concentrated solution (25 mM) diluted in distilled water |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare a 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | |
| Monowave glass vial | Anton Paar | 82723_us | |
| Microwave reactor | Anton Paar | Monowave 300 | |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma Aldrich | 416010 | MW = 1200 g/mol |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Sodium hydroxide, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35629 | |
| Sodium pyruvate solution 100mM | Sigma | S8636 | |
| Sterile conical centrifuge tube | Falcon | 352097 | 15 mL tubes |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare a 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Tri-Sodium Citrate Dihydrate, Certified AR for Analysis | Sigma Aldrich | 10396430 | |
| Ultra centrifugal filter | Amicon | AC S510024 |
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