Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

توليف Aptamer-PEI-g-PEG الجسيمات النانوية الذهبية المعدلة المحملة بدوكسوروبيسين لتسليم الأدوية المستهدفة

Published: June 23, 2020 doi: 10.3791/61139
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 3, 3, 3
1College of Life Sciences, Xinyang Normal University, 2Department of Imaging & Pathology, University of Leuven and Oral & Maxillofacial Surgery, University Hospitals Leuven, 3Analysis & Testing Center, Xinyang Normal University

Summary

في هذا البروتوكول، يتم تصنيع الجسيمات النانوية الذهبية المعدلة AS1411-g-PEI-g-PEG المحملة بالدوكسوروبيسين عبر ردود فعل وسطية من ثلاث خطوات. ثم، يتم تحميل الدوكسوروبيسين وتسليمها لاستهداف الخلايا السرطانية لعلاج السرطان.

Abstract

بسبب مقاومة الأدوية والسمية في الخلايا السليمة ، كان استخدام الدوكسوروبيسين (DOX) محدودا في علاج السرطان السريري. يصف هذا البروتوكول تصميم بولي (إيثيلينمين) المطعمة بالبولي إيثيلين غليكول (PEI-g-PEG) الجسيمات النانوية الذهبية الوظيفية (AuNPs) مع aptamer محملة (AS1411) و DOX من خلال ردود الفعل وسط. AS1411 هو المستعبدين على وجه التحديد مع مستقبلات النيوكليولين المستهدفة على الخلايا السرطانية بحيث DOX يستهدف الخلايا السرطانية بدلا من الخلايا السليمة. أولا ، يتم ترقيع PEG ، ثم تطعيمه إلى جزيرة الأمير إدوارد المتفرعة للحصول على COPOlymer PEI-g-PEG ، والذي يتم تأكيده من خلال تحليل 1H NMR. بعد ذلك ، يتم تصنيع الجسيمات النانوية الذهبية المغلفة من PEI-g-PEG (PEI-g-PEG@AuNPs) ، ويتم ربط DOX و AS1411 بشكل متناقض ب AuNPs تدريجيا عبر ردود الفعل المتوسطة. يبلغ قطر AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs حوالي 39.9 نانومتر، مع إمكانية زيتا تبلغ -29.3 mV، مما يشير إلى أن الجسيمات النانوية مستقرة في الماء والخلايا المتوسطة. تظهر فحوصات السمية الخلوية أن DOX المصمم حديثا محملة AuNPs قادرة على قتل الخلايا السرطانية (A549). يوضح هذا التجميع الترتيب الدقيق ل COPOlymers PEI-g-PEG و aptamers و DOX على AuNPs التي تتحقق من خلال ردود الفعل المتتالية. توفر هذه البرامج الوطنية للرعاية الوظيفية aptamer-PEI-g-PEG منصة واعدة لتوصيل الأدوية المستهدفة في علاج السرطان.

Introduction

كونها مشكلة الصحة العامة الرئيسية في جميع أنحاء العالم، ويتميز السرطان على نطاق واسع بأنها لديها معدل علاج منخفض، وارتفاع معدل تكرار، وارتفاع معدل الوفيات1،2. وتشمل الطرق التقليدية الحالية لمكافحة السرطان الجراحة والعلاج الكيميائي والعلاج الإشعاعي3، من بينها العلاج الكيميائي هو العلاج الأساسي لمرضى السرطان في العيادة4. الأدوية المضادة للانسان المستخدمة السريرية تشمل أساسا باكليتاكسيل (PTX)5 ودوكسوروبيسين (DOX)6،7. DOX، دواء antineoplastic، وقد تم تطبيقها على نطاق واسع في العلاج الكيميائي السريري، وذلك بسبب مزايا السمية الخلوية السرطان وتثبيط انتشار الخلايا السرطانية8،9. ومع ذلك، DOX يسبب السمية القلبية10،11، وقصيرة نصف عمر DOX يقيد تطبيقه في العيادة12. ولذلك، هناك حاجة إلى ناقلات المخدرات القابلة للتحلل لتحميل DOX وإطلاقها دون المستوى بطريقة خاضعة للرقابة إلى منطقة مستهدفة.

وقد استخدمت الجسيمات النانوية على نطاق واسع في نظم تسليم الأدوية المستهدفة ولها عدة مزايا في علاج السرطان (أي نسبة كبيرة من السطح إلى الحجم، والحجم الصغير، والقدرة على تغليف الأدوية المختلفة، والكيمياء السطحية غير القادرة، وما إلى ذلك) 13،14،15. على وجه الخصوص، وقد استخدمت الجسيمات النانوية الذهب (AuNPs) على نطاق واسع في التطبيقات البيولوجية والطب الحيوي، مثل العلاج بالسرطان الحراري الضوئي16،17. خصائص فريدة من نوعها من AuNPs، مثل توليف سهل والوظيفية السطحية العامة، لديها آفاق ممتازة في المجال السريري لعلاج السرطان18. أيضا، وقد استخدمت AuNPs لتحديد استراتيجيات تسليم الأدوية، وتشخيص الأورام، والتغلب على المقاومة في العديد من الدراسات19،20.

وعلى الرغم من ذلك، تحتاج برامج تحديد الاحتياجات إلى مزيد من التهيئة للتغلب على مقاومة الأدوية عن طريق إطلاق سراح محلي مرتفع في آفات الأورام من خلال تعزيز النفاذ والاستبقاء، مثل خصائص الاستهداف وإمكانية الوصول. البوليمر وظيفية AuNPs أظهرت مزايا فريدة من نوعها، مثل تحسين الذوبان المياه من الأدوية المضادة للماء وتداول لفترة طويلة21،22. وقد استخدمت البوليمرات المتوافقة بيولوجيا مختلفة لطلاء AuNP، مثل جليكول البولي ايثيلين (PEG)، البولي ايثيلينيمين (PEI)، حمض الهيالورونيكس، الهيبارين، واللثة زانثان. ثم يتم تحسين الاستقرار، فضلا عن الحمولة، من AuNPs بشكل جيد23. على وجه التحديد، PEI هو البوليمر المتفرعة للغاية التي تتكون من العديد من الوحدات المتكررة من الأمينات الابتدائية والثانوية والثالثة24. جزيرة الأمير إدوارد لديها الذوبان ممتازة، وانخفاض اللزوجة، ودرجة عالية من الوظائف، والتي هي مناسبة للطلاء على AuNPs.

من ناحية أخرى، تحتاج الأدوية المضادة للسرطان إلى تسليمها إلى الخلايا السرطانية مباشرة مع تحسين كفاءة التحميل، ومع انخفاض سمية لعلاج الأورام النقيلية الأولية والمتقدمة25. ligands المستهدفة لديها إمكانات كبيرة لمكافحة السرطان المخدرات المستهدفة نظم التسليم26. انتقائيتها لربط جزيء الهدف يمنح الأدوية المضادة للسرطان استهداف خصوصية ويزيد من إثراء المخدرات في الأنسجة المريضة27. المزيد من الليغند تشمل الأجسام المضادة، والبوليبيدات، والجزيئات الصغيرة. بالمقارنة مع غيرها من ليغاندس، يمكن توليفها aptamers حمض النوى في المختبر وسهلة التعديل. AS1411 هو غير معدلة 26 bp phosphodiester oligonucleotide التي تشكل مستقرة ثنائية الديمير G-tetramer هيكل لربط على وجه التحديد إلى مستقبلات البروتين النووي الهدف مفرط التعبير على الخلايا السرطانية28,29,30. AS1411 يمنع انتشار العديد من الخلايا السرطانية ولكن لا يؤثر على نمو الخلايا السليمة31,32. ونتيجة لذلك، تم استخدام AS1411 لتصنيع نظام مثالي لتسليم الأدوية المستهدفة.

في هذه الدراسة، يتم تصنيع كوبوليمر PEI-g-PEG عن طريق رد فعل وسطي، ثم يتم تصنيع الجسيمات النانوية الذهبية المغلفة من PEI-g-PEG (PEI-g-PEG@AuNPs). بالإضافة إلى ذلك، ترتبط DOX و AS1411 بشكل تسلسلي بجزيرة الأمير إدوارد-g-PEG@AuNPs المعدة، كما هو موضح في الشكل 1. يهدف هذا البروتوكول المفصل إلى مساعدة الباحثين على تجنب العديد من المزالق الشائعة المرتبطة باختلاق PEG@AuNPs PEI-g-PEG@AuNPs الجديدة المحملة ب DOX و AS1411.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تنبيه: تأكد من استشارة جميع أوراق بيانات سلامة المواد ذات الصلة (MSDS) قبل استخدام جميع المواد الكيميائية. العديد من المواد الكيميائية المستخدمة لإعداد الكوبوليمر والجسيمات النانوية سامة للغاية. الجسيمات النانوية لديها أيضا مخاطر محتملة. تأكد من استخدام جميع ممارسات السلامة المناسبة ومعدات الحماية الشخصية، بما في ذلك القفازات ومعطف المختبر وأغطية الرأس والسراويل كاملة الطول والأحذية القريبة.

1. تركيب مزدوجة كاربوسيل البولي ايثيلين غليكول (CT-PEG)33

  1. إضافة 1.46 غرام (14.6 مليمول) من أنهيدريد succinic (SA) و 209 ملغ (1.71 ملليمول) من 4-dimethylaminopyridine (DMAP) إلى قارورة أسفل جولة 100 مل.
  2. أضف 15 مل من رباعي هيدروفوران اللامائية (THF) إلى القارورة المستخدمة في الخطوة 1.1 ولائم سدادة زجاجية. احتفظ بالقارورة عند 0 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. أضف 4.28 غرام (4.28 ملليمول) من غليكول البولي إيثيلين (PEG) و1.8 مل (12.8 ملليمول) من ثلاثي الإيثيلامين (TEA) إلى قارورة جديدة.
  4. أضف 15 مل من THF اللامائية إلى القارورة المستخدمة في الخطوة 1.3 ولائم سدادة زجاجية. نقل المحلول ببطء إلى القارورة المستخدمة في الخطوة 1.2، وذلك باستخدام حقنة تحت الغلاف الجوي النيتروجين.
  5. يحرك المحلول عند 0 درجة مئوية لمدة 2 ساعة، ثم يواصل التفاعل في درجة حرارة الغرفة (RT) بين عشية وضحاها.
  6. باستخدام المبخر الدوار (40 درجة مئوية، 0.1 MPa)، ركز محلول التفاعل وأزل مذيب THF.
  7. في RT، حل محلول رد الفعل من الخطوة 1.6 في 15 مل من 1.325 غرام / مل ثنائي كلورو الميثان (DCM)، ثم إضافة 15 مل من الأثير ديثيل الباردة (Et2O) للحصول على المنتج هطول الأمطار (البولي ايثيلين غليكول دياسيد). قم بإزالة المذيبات عبر ورق التصفية.
    ملاحظة: يمكن تكرار الخطوة هطول الأمطار 3x.
  8. تجفيف الرواسب تحت فراغ في RT لمدة 48 ساعة.

2. توليف PEI-g-PEG كوبوليمر

  1. إضافة 305.47 ملغ من CT-PEG من الخطوة 1.8 و 5 مل من كبريتسيد ثنائي ميثيل (DMSO) إلى قارورة ويحرك في RT لضمان أن CT-PEG يذوب تماما في DMSO.
  2. حل 49.46 ملغ من 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-إيثيلكاربوديميد هيدروكلوريد (EDC) في 5 مل من DMSO، ثم إضافة الحل إلى قارورة المستخدمة في الخطوة 2.1 ويحرك لمدة 30 دقيقة في RT.
  3. حل 29.69 ملغ من N-هيدروكسيسوتشينيميد (NHS) في 5 مل من DMSO وإضافة الحل إلى قارورة المستخدمة في الخطوة 2.1. الاستمرار في اثارة في RT لمدة 3 ساعة.
  4. حل 28.6 ميكرولتر من البولي ايثيلينيمين (PEI) في 10 مل من DMSO وإضافة الحل دروبياسي إلى قارورة المستخدمة في الخطوة 2.1. يحرك المزيج لمدة 3 أيام على الأقل.
  5. نقل الحل تفاعل من الخطوة 2.4 إلى كيس غسيل الكلى (1000 خفض الوزن الجزيئي [MWCO]). ضع كيس غسيل الكلى في كوب 1 لتر مع 500 مل من المياه فائقة النبور كطايب. تغيير المياه فائقة النبور كل 12 ساعة لمدة 3 أيام.
  6. نقل الحل في الخطوة 2.5 إلى كيس غسيل الكلى آخر (10،000 MWCO). ضع كيس غسيل الكلى في كوب 1 لتر مع 500 مل من المياه فائقة النبور كطايب. تغيير المياه فائقة النبور كل 12 ساعة لمدة 3 أيام.
  7. ركز المحلول من الخطوة 2.6 باستخدام المبخر الدوار (40 درجة مئوية، 0.1 MPa) وجفف العينة للحصول على مسحوق PEI-g-PEG.

3. تركيب PEI-g-PEG@AuNPs

  1. حل 5 ملغ من إعداد PEI-g-PEG (الخطوة 2.7) في 5 مل من المياه فائقة البور في قارورة جديدة وتناسب مع سدادة زجاجية.
  2. إضافة 100 مل من 0.3 mM HAuCl4 حل للقارورة وتحريك الحل لمدة 3 ساعة في RT.
    ملاحظة: يجب تغيير لون الحل مباشرة من الأصفر إلى البرتقالي.
  3. إضافة 1 مل من محلول 1 ملغم/مل NaBH4 إلى القارورة وتحريك الحل لمدة 3 ساعة في RT.
    ملاحظة: يجب أن يتحول حل رد الفعل على الفور إلى بورجوندي.
  4. Dialyze المنتج رد فعل باستخدام كيس غسيل الكلى (1000 MWCO) لمدة 3 أيام على النحو المبين في الخطوة 2.5 للحصول على حل PEI-g-PEG@AuNPs.

4. توليف DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs

  1. أضف 1 مل من محلول DOX 2.2 ملغم/مل و20 مل من محلول PEI-g-PEG@AuNPs إلى قارورة جديدة وتناسب سدادة زجاجية.
  2. حل 0.727 ملغ من EDC في 1 مل من المياه فائقة البور وإضافة محلول EDC إلى القارورة المستخدمة في الخطوة 4.1.
  3. حل 0.437 ملغ من NHS في 1 مل من المياه فائقة النبور. إضافة حل NHS إلى القارورة ويحرك في RT لمدة 1 ساعة.
  4. Dialyze المنتج رد فعل باستخدام كيس غسيل الكلى (1000 MWCO) لمدة 3 أيام على النحو المبين في الخطوة 2.5 للحصول على DOX-G-PEI-g-PEG@AuNPs الحل.

5. توليف AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs

  1. أضف 20 مل من محلول DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs و4OD من AS1411 (OD = الكثافة البصرية؛ 1OD ≈ 33 ميكروغرام) إلى قارورة جديدة.
  2. حل 28.76 ملغ من EDC في 1 مل من المياه فائقة البور وإضافة محلول EDC إلى القارورة المستخدمة في الخطوة 5.1.
  3. حل 17.27 ملغ من NHS في 1 مل من المياه فائقة النبور. أضف حل NHS إلى القارورة المستخدمة في الخطوة 5.1 وحرك رد الفعل لمدة ساعة واحدة في RT.
  4. Dialyze المنتج رد فعل باستخدام كيس غسيل الكلى (1000 MWCO) لمدة 3 أيام كما هو موضح في الخطوة 2.5 للحصول على AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.

6. توصيف العينة

  1. حل البوليمر CT-PEG (الخطوة 1.8) و PEI-g-PEG copolymer (الخطوة 2.7) في الكلوروفورم-د في أنابيب الرنين المغناطيسي النووي (NMR) على التوالي. تحليل العينات باستخدام مطياف NMR 600 ميغاهرتز مجهزة 14.09 T المغناطيس فائق التوصيل و 5.0 مم 600 ميغاهيرتز النطاق العريض Z-التدرج عالية الدقة التحقيق لتأكيد التركيب الكيميائي34.
  2. تفريق AuNPs، DOX، و AS1411، وأعدت PEI-g-PEG@AuNPs (الخطوة 3.4)، DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (الخطوة 4.4)، و AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (الخطوة 5.4)، على التوالي في المياه فائقة النبور. ثم، نقل إلى cuvettes وتسجيل الأشعة فوق البنفسجية مرئية (الأشعة فوق البنفسجية فيس) أطياف باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية فيس.
  3. إرفاق لاصقة على الوجهين (~ 2 ملم × 2 ملم) إلى رقائق الألومنيوم، وتراجع الحل عينة (PEI-g-PEG@AuNPs، DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs، و AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs) على الشريط بأكمله بشكل موحد. تحليل العينات باستخدام محلل الطيف الضوئي بالأشعة السينية.
  4. تفريق PEI-g-PEG@AuNPs، DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs، وحلول AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs، على التوالي في المياه فائقة النبور. ثم، نقل إلى cuvettes وتقييم توزيع الحجم باستخدام تشتت الضوء الديناميكي.
  5. تفريق PEI-g-PEG@AuNPs، DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs، وحلول AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs في المياه فائقة النبور (قطرة عينة واحدة لكل 5 مل من المياه فائقة النبور لكل عينة). سونيكاتي لمدة 2 ساعة. تراجع شبكة النحاس في حلول العينة والجافة تحت مصباح الأشعة تحت الحمراء. تميز مورفولوجيا باستخدام المجهر الإلكتروني انتقال.
  6. حقن 1 ملغ من AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs في شريط غسيل الكلى 20 kDa MWCO، ثم ضع في 80 مل من المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) مع 5٪ ألبوم مصل البقر (BSA). يحرك عند 37 درجة مئوية.
  7. في النقاط الزمنية المحددة مسبقا، وجمع 100 μL aliquots واستبدالها مع برنامج تلفزيوني جديد. استخدم مطياف الأشعة فوق البنفسجية لقياس كثافة مضان DOX للعليكوت.

7. CCK-8 المقايسة AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs الجسيمات النانوية

  1. تنمو خلايا A549 في المتوسط النسر المعدلة دولبيكو (DMEM) تكملها مع 10٪ مصل البقر الجنيني، 100 U/mL البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل streptomycin تحت جو رطب من الهواء 95٪ و 5٪ CO2 في 37 درجة مئوية. استبدل الوسط الثقافي كل يومين. استخدام الخلايا في الممر 5 لانتشار الخلايا وتقييس السمية الخلوية لتقييم كميا السمية الخلوية للجسيمات النانوية المعدة AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.
  2. إضافة 100 ميكرولتر من محلول الجسيمات النانوية في كل احتواء جيدا 1 مل من متوسط الخلية. بعد زراعة لمدة 24 ساعة و 48 ساعة، وإزالة وسائل الإعلام الثقافة من لوحات ثقافة الخلية، ثم إضافة 300 ميكروغرام من وسائل الإعلام ثقافة جديدة و 30 ميكرولتر من الخلايا العد عدة-8 (CCK-8) عدة حلول فورا إلى كل بئر. حضانة لمدة 4 ساعة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 في 37 درجة مئوية.
  3. نقل 200 ميكرولتر من حلول رد الفعل من الخطوة 7.2 إلى لوحة بئر 96. قراءة الكثافة البصرية (OD) من كل بئر في 570 نانومتر مع قارئ microplate.
  4. مراقبة مورفولوجيا الخلايا في 24 ساعة و 48 ساعة تحت المجهر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

1 تم استخدام التحليل الطيفي H NMR لتأكيد التوليف الناجح لبوليمر CT-PEG و PEI-g-PEG copolymers(الشكل 2). ويبين الشكل 2أ أن إشارة بروتون الميثيلين عند δ = 3.61 جزء في المليون وإشارة بروتون الكربوسيل عند δ = 2.57 جزء في المليون تؤكد التوليف الناجح لبوليمرات CT-PEG. ويبين الشكل 2ب أن إشارة بروتون الميثيلين من PEG عند δ = 2.6 جزء في المليون وإشارة البروتون من جزيرة الأمير إدوارد في δ = 1.66 جزء في المليون تؤكد تركيب بي آي جي-PEG copolymers.

وأجريت الأشعة فوق البنفسجية فيس التحليل الطيفي لتحديد وظيفية ناجحة من copolymer أعدت على AuNPs (الشكل 3). في الأشعة فوق البنفسجية في مقابل الأطياف، وجود العصابات في ~ 523 نانومتر، 507 نانومتر، و 260 نانومتر يتوافق مع سطح البلازمون الرنين (SPR) قمم أونبس، DOX، و AS1411، على التوالي (الشكل 3a). العصابات في ~ 360 نانومتر في الأشعة فوق البنفسجية فيس الطيف من PEI-g-PEG@AuNPs، ~ 532 نانومتر في الطيف للأشعة فوق البنفسجية فيس من DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs، و ~ 546 نانومتر في الطيف الأشعة فوق البنفسجية فيس من AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs تؤكد التوليف الناجح للكوبوليمرات PEI-g-PEG المرفقة ب AuNPs. كما أنها تؤكد أن DOX و AS1411 تم تحميلها على AuNPs وظيفية تدريجيا(الشكل 3ب).

تم استخدام التحليل الطيفي للإلكترونات الضوئية بالأشعة السينية (XPS) للتحقيق في الرابط الكيميائي للكوبوليمر على AuNPs(الشكل 4). أظهر الطيف XPS من PEI-g-PEG@AuNPs C1s و O1s و N1s و Au4f القمم تشير إلى الصلة بين AuNPs و PEI-g-PEG copolymer(الشكل 4a). حدث تغيير طفيف في الطيف XPS من DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs، حيث تم تطعيم DOX بشكل أكبر على PEI-g-PEG@AuNPs(الشكل 4b). وعلاوة على ذلك، فإن ظهور ذروة P2P ل AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs يرجع بشكل رئيسي إلى الكسب غير المشروع الناجح ل AS1411 على DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs(الشكل 4c). تم تحليل توزيع حجم الجسيمات النانوية المعدة باستخدام DLS (الشكل 5). وبالمقارنة مع PEG@AuNPs، زاد متوسط قطر الترطيب قليلا في DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs وزاد مرة أخرى بمجرد تطعيم AS1411.

تم استخدام TEM لتحديد مورفولوجيا الجسيمات النانوية ، وأظهرت الصور أن جميع الجسيمات النانوية كانت موحدة دون تجميع(الشكل 6). بسبب التفاعلات بين copolymers على سطح AuNPs ، زادت المسافة بين AuNPs تدريجيا. تم استخدام اختبار صلاحية الخلية لتحديد الخاصية المستهدفة لنظام تسليم DOX المعد(الشكل 7 والشكل 8). وأظهرت نتائج CCK-8(الشكل 7)أن 1) انخفض عدد خلايا A549 بعد الاستزراع مع AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs بمرور الوقت و2) انخفض عدد الخلايا مع زيادة تركيز الجسيمات النانوية. وبالمقارنة مع مجموعة DOX المجانية، زاد عدد الخلايا، مما يشير إلى أن السمية قد انخفضت.

جنبا إلى جنب مع الصور المجهرية البصرية (الشكل 8)، تظهر النتائج أن عدد الخلايا انخفض بعد زراعة مع AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (الشكل 8a−d) مقارنة بمجموعة التحكم دون إضافة جسيمات نانوية(الشكل 8e,f). وعلاوة على ذلك، تم التحقيق في ملف تعريف إصدار DOX من AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs في PBS(الشكل 9). وتظهر النتائج أن الإطلاق المستدام ل DOX من الجسيمات النانوية الوظيفية تسبب في انخفاض في خلايا A549 ، وكان الإصدار التراكمي DOX حوالي 63.5٪ ± 3.2٪ عند 72 ساعة.

Figure 1
الشكل 1: رسم تخطيطي لتركيب PEI-g-PEG@AuNP، و DOX-g-PEI-g-PEG@AuNP، و AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNP. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: 1 أطيافه نمر من (أ) توليفها CT-PEG البوليمر و (ب) PEI-g-PEG copolymer. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: أطياف الأشعة فوق البنفسجية ل (أ) الملوثات المضادة للانزعاج، ودوكس، و AS1411، و(ب) PEI-g-PEG@AuNPs، و DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs، و AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: أطياف XPS من (أ) PEI-g-PEG@AuNPs، (ب) DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs، و(ج) AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: توزيع حجم جزيرة الأمير إدوارد-ز-PEG@AuNPs، ودوكس-ز-بي-ز-PEG@AuNPs، و AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.
d.nm = متوسط قطر الجسيمات النانوية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: صور TEM ل(أ) PEI-g-PEG@AuNPs و(ب) DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs و(ج) AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.
أشرطة المقياس = 50 نانومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: قيم الكثافة البصرية عند 570 نانومتر (OD570)من خلايا A549 بعد زراعة الخلايا مع AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (220 ميكروغرام/مل و110 ميكروغرام/مل) لمدة 24 ساعة و48 ساعة على التوالي.
يتم تضمين الخلايا مع DOX الحرة والخلايا دون إضافة الجسيمات النانوية ومجموعات التحكم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: الصور المجهرية البصرية لخلايا A549 بعد زراعة الخلايا مع AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs عند 220 ميكروغرام/مل (a,b) و110 ميكروغرام/مل (c,d)، أو زراعة دون إضافة جسيمات نانوية كمجموعة تحكم (e,f) عند 24 ساعة (الألواح العلوية) و48 ساعة (الألواح السفلية). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: نبذة عن DOX من AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs في PBS لمدة 72 ساعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

1H NMR الطيف (الشكل 2) تأكيد التوليف الناجح للكزوليمر CT-PEG و PEI-g-PEG copolymer. وكانت الأوزان الجزيئية ل PEG و PEI 1000 و 1200 على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام نظام تحفيز EDC / NHS لتجميع PEI-g-PEG copolymer عبر ردود الفعل. وتجدر الإشارة إلى أنه إذا تغيرت الأوزان الجزيئية ل PEG و PEI لتوليف PEI-g-PEG copolymer ، فيجب إعادة تقييم وقت التفاعل والنظام الحفاز. أيضا ، فإن حالة رد الفعل لطلاء COPOlymer PEI-g-PEG على AuNPs تحتاج إلى مزيد من التعديل ، ويرجع ذلك بشكل رئيسي إلى أن وزن الجزيء وهيكل PEG-g-PEI copolymer يمكن أن يؤثر على كفاءة الطلاء وقطر AuNPs. بعد ذلك ، يمكن تغيير مورفولوجيا AuNPs الوظيفية copolymer ، كذلك. يمكن أن يؤثر عدد المجموعات الأمينية من بوليمر PEI على بنية توليف PEI-g-PEG copolymer النهائي ، وسيقع حتما عمل الربط المتبادل بين PEI و CT-PEG. وبالتالي، يجب تنفيذ الخطوة 2.4 بعناية، وينبغي إضافة حل جزيرة الأمير إدوارد ببطء قطرة ب قطرة. بعد التفاعل التوليفي ، يحتاج غسيل الكلى (الخطوتين 2.5 و 2.6) إلى إجراء عملية لإزالة البوليمرات المتقاطعة والبوليمرات غير المتفاعلة.

وعلاوة على ذلك، يتم تشغيل DOX و AS1411 بشكل تسلسلي على PEI-g-PEG@AuNPs عبر ردود الفعل المتوسطة، ويتم استخدام نظام التحفيز EDC/NHS. يتطلب 3 أيام لكل رد فعل (الخطوة 4.3 والخطوة 5.3) هنا؛ ومع ذلك، إذا كان وقت رد الفعل يتطلب أقل من 3 أيام، فإن كفاءة التشغيل ستنخفض. عند الحاجة إلى أكثر من 3 أيام ، تم الحصول على نفس النتيجة. وتجدر الإشارة إلى أنه يمكن إزالة EDC الكيميائية، NHS، ودوكس غير متصل أو AS1411 من خلال علاج غسيل الكلى (الخطوة 4.4 والخطوة 5.4). الأشعة فوق البنفسجية فيس الأطياف وXPS هي أساليب فعالة للتحقيق في وظيفية ناجحة من copolymer على الجسيمات النانوية، وتم الحصول على نتائج متسقة(الشكل 3 والشكل 4).

تختلف عن العصابات المميزة للأشعة فوق البنفسجية في مقابل من AuNPs، DOX، و AS1411، قمم فريدة من PEI-g-PEG@AuNPs، DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs، و AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs صعبة لمراقبة، وذلك بسبب تداخل كل قمة. وعلاوة على ذلك، قمنا بأداء طريقة مختلفة لتصنيع DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (توليف DOX-g-PEI-g-PEG أولا، وإنجاز التشغيل على AuNPs)؛ ومع ذلك، فقد أدى الذهب النانوية باستخدام مثل هذا النهج إلى انخفاض DOX كفاءة التحميل35،36. وبالتالي، تجدر الإشارة إلى أن طريقة توليف DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs في هذا العمل ستضمن كفاءة تحميل DOX كافية بالإضافة إلى مزيد من ملف تعريف الإصدار. إذا كانت التجربة لا تأخذ DOX كفاءة التحميل من الجسيمات النانوية الذهب في الاعتبار، وهناك طرق أخرى للحصول على AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs. وتشمل هذه التوليف من DOX-g-PEI-g-PEG أو AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG عبر رد فعل وسط أولا، ثم وظيفية على الجسيمات النانوية الذهبية. وهكذا، يمكن تطبيق الطريقة المستخدمة هنا وكذلك copolymers التي تم الحصول عليها على التطبيقات الطبية المتنوعة، مثل هندسة الأنسجة.

يمكن التحقيق في توزيع حجم ومورفولوجيا الجسيمات النانوية المعدة من قبل DLS و TEM. بيانات DLS (الشكل 5) تظهر أن الجسيمات النانوية قطر الترطيب تختلف من الطلاءات المختلفة، وأكثر من ذروة واحدة تظهر لكل عينة. وفيما يتعلق بهيكل PEI-g-PEG(الشكل 1)،لا يلاحظ منحنى التوزيع الطبيعي ل DLS. وتجدر الإشارة إلى أن الجسيمات النانوية موزعة في المياه فائقة النذر أثناء اختبار DLS ، وتستخدم نسب حجم مختلفة ، ولا تزال هناك قمم متعددة ، بسبب التفاعلات بين copolymers على سطح الجسيمات النانوية. وهكذا، يتم استخدام صور TEM لتأكيد مورفولوجيا الجسيمات النانوية. تظهر صور TEM ل PEI-g-PEG@AuNPs و DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs و AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs في الشكل 6.

استنادا إلى مكونات مختلفة من أسطح الجسيمات النانوية الذهبية ، تتغير المسافات بين الجسيمات النانوية. الى جانب ذلك، الجسيمات النانوية المعدة المنتشرة في الماء مستقرة وفقا لاختبارات زيتا المحتملة (-29 إلى 50 mV للجسيمات النانوية المختلفة بعد اختبارات الزمن). ولا يؤثر المزيد من التشغيل الوظيفي لدوكس و AS1411 (القسمان 4 و 5 من البروتوكول) على قطر الجسيمات النانوية الذهبية. ويمكن استنتاج أن الأشعة فوق البنفسجية فيس هو وسيلة فعالة لتأكيد DOX و AS1411 تحميلها على الجسيمات النانوية دون استخدام جميع أساليب الاختبار.

تم التحقيق في الخاصية المستهدفة على الخلايا السرطانية باستخدام خلايا A549 المستزرعة بتركيزات مختلفة من AS1411 المعدة و DOX تحميل AuNPs ودون إضافة الجسيمات النانوية كمجموعة مراقبة. وفي الوقت نفسه، تم اختبار آثار DOX الحرة على قدرة الخلية A549 أيضا(الشكل 7 والشكل 8). بالمقارنة مع المجموعة دون إضافة جسيمات نانوية ، فإن AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs يؤدي إلى انخفاض في خلايا A549. ومع ذلك ، في حين أن تركيز الجسيمات النانوية ينخفض (100 ميكروغرام / مل) ، تظهر الخلايا نشاطا أفضل عند 24 ساعة مقارنة بمجموعة DOX المجانية. ويرجع ذلك أساسا إلى أن بي آي-جي-PEG copolymer لديه توافق خلوي ممتاز37 ويتم تحسين السمية غير المحددة لبوليمر PEI المتفرع.

وأخيرا، بسبب الخاصية المستهدفة من APTAMER AS1411، تتراكم الجسيمات النانوية التي تم الحصول عليها في الخلايا السرطانية بدلا من الخلايا السليمة. بمجرد التعرف على aptamer ، يتم تحرير DOX لقتل الخلايا السرطانية. تم تسجيل ملف الافراج عن DOX من AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs في برنامج تلفزيوني(الشكل 9). هذا البروتوكول يدل على نهج لإعداد aptamers و DOX المطعمة على copolymer تعديل AuNPs عن طريق رد فعل وسطي متعدد الخطوات. الجسيمات النانوية المركبة لديها القدرة على تطبيقات علاج السرطان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

تم تمويل هذا البحث من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31700840)؛ مشروع البحث العلمي الرئيسي لمقاطعة خنان (18B430013, 18A150049). وقد تم دعم هذا البحث من قبل برنامج علماء نانهو للعلماء الشباب من XYNU. ويود المؤلفون أن يشكروا طالب البكالوريوس زيبو كو من كلية علوم الحياة في XYNU على أعماله المفيدة. ويود المؤلفون أن يعترفوا بمركز التحليل والاختبار في XYNU لاستخدام معداتهم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Dimethylaminopyridine Macklin D807273
A549 cell ATCC CCL-185TM
AS1411 BBI Life Sciences Corporation 5'-d (TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG) FL-AS1411 (fluorophore-labeled AS1411)
Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd
Cell counting kit-8 (CCK-8) Sigma Aldrich 96992-500TESTS-F
Dichloromethane Traditional Chinese medicine 80047318
Diethyl ether (Et2O) SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd
Dimethyl sulfoxide Macklin D806645
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) Sigma Aldrich
Doxorubicin hydrochloride Rhawn R017518
Ether absolute Traditional Chinese medicine 80059618
Field Emission Transmission Electron Microscope FEI Company Tecnai G2 F 20
Gold(III) chloride trihydrate Rhawn R016035
Laser Particle-size Instrument Malvern Instruments Ltd ZetasizerNanoZS/Masterszer3000E
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax 190
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride Macklin N808856
N-Hydroxysuccinimide Macklin H6231
NMR software Delta 5.2.1
Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer JEOL JNM-ECZ600R/S3
Origin 8.5 OriginLab
Penicillin Sigma Aldrich V900929-100ML
Phosphate-buffered saline Sigma Aldrich P4417-100TAB
Poly(ethylene glycol) Sigma Aldrich 81188 BioUltra, average Mn ~ 1000
Poly (ethyleneimine) solution Sigma Aldrich 482595 average Mn ~ 1200, 50 wt.% in H2O
Sodium borohydride, powder Acros C18930
Streptomycin Sigma Aldrich 85886-10ML
Succinic anhydride Traditional Chinese medicine 30171826
Tetrahydrofuran Traditional Chinese medicine 40058161
Triethylamine Traditional Chinese medicine 80134318
UV/VIS/NIR Spectrometer Lambda950 Lambda950
X-ray Photoelectron Spectrometer Thermo Fisher Scientific K-ALPHA 0.5EV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abad, J. M., Bravo, I., Pariente, F., Lorenzo, E. Multi-tasking base ligand: a new concept of AuNPs synthesis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (9), 2329-2338 (2016).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA-A Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
  3. Jang, B., Kwon, H., Katila, P., Lee, S. J., Lee, H. Dual delivery of biological therapeutics for multimodal and synergistic cancer therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 98, 113-133 (2016).
  4. Gansler, T., et al. Sixty years of CA: a cancer journal for clinicians. CA-A Cancer Journal for Clinicians. 60 (6), 345-350 (2010).
  5. Li, J., et al. Molecular Mechanism for Selective Cytotoxicity towards Cancer Cells of Diselenide-Containing Paclitaxel Nanoparticles. International Journal of Biological Sciences. 15 (8), 1755-1770 (2019).
  6. Zhao, D., et al. Precise ratiometric loading of PTX and DOX based on redox-sensitive mixed micelles for cancer therapy. Colloids Surfaces B: Biointerfaces. 155, 51-60 (2017).
  7. Blum, R. H., Carter, S. K. Adriamycin. A new anticancer drug with significant clinical activity. Annals of Internal Medicine. 80 (2), 249-259 (1974).
  8. de Lima, R. D. N., et al. Low-level laser therapy alleviates the deleterious effect of doxorubicin on rat adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Journal of Photochemistry Photobiology B. 196, 111512 (2019).
  9. Markowska, A., Kaysiewicz, J., Markowska, J., Huczynski, A. Doxycycline, salinomycin, monensin and ivermectin repositioned as cancer drugs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 29 (13), 1549-1554 (2019).
  10. Songbo, M., et al. Oxidative stress injury in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Toxicology Letters. 307, 41-48 (2019).
  11. Ewer, M. S., Ewer, S. M. Cardiotoxicity of anticancer treatments. Nature Reviews Cardiology. 12 (9), 547-558 (2015).
  12. Gabizon, A., Shmeeda, H., Barenholz, Y. Pharmacokinetics of pegylated liposomal Doxorubicin: review of animal and human studies. Clinical Pharmacokinetics. 42 (5), 419-436 (2003).
  13. Xu, X., Ho, W., Zhang, X., Bertrand, N., Farokhzad, O. Cancer nanomedicine: from targeted delivery to combination therapy. Trends in Molecular Medicine. 21 (4), 223-232 (2015).
  14. Feng, S., Nie, L., Zou, P., Suo, J. Effects of drug and polymer molecular weight on drug release from PLGA-mPEG microspheres. Journal of Applied Polymer Science. 132 (6), 41431 (2015).
  15. Chen, D., et al. Injectable Temperature-sensitive Hydrogel with VEGF Loaded Microspheres for Vascularization and Bone Regeneration of Femoral Head Necrosis. Materials Letters. 229, 138-141 (2018).
  16. Abadeer, N. S., Murphy, C. J. Recent Progress in Cancer Thermal Therapy Using Gold Nanoparticles. The Journal of Physical Chemistry C. 120 (9), 4691-4716 (2016).
  17. Riley, R. S., Day, E. S. Gold nanoparticle-mediated photothermal therapy: applications and opportunities for multimodal cancer treatment. WIREs Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (4), 1449 (2017).
  18. Fratoddi, I., et al. Highly Hydrophilic Gold Nanoparticles as Carrier for Anticancer Copper(I) Complexes: Loading and Release Studies for Biomedical Applications. Nanomaterials (Basel). 9 (5), 772 (2019).
  19. Lee, S. M., et al. Drug-loaded gold plasmonic nanoparticles for treatment of multidrug resistance in cancer. Biomaterials. 35 (7), 2272-2282 (2014).
  20. Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. The golden age: gold nanoparticles for biomedicine. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2740-2779 (2012).
  21. Wei, T., et al. Anticancer drug nanomicelles formed by self-assembling amphiphilic dendrimer to combat cancer drug resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (10), 2978-2983 (2015).
  22. Galluzzi, L., Buque, A., Kepp, O., Zitvogel, L., Kroemer, G. Immunological Effects of Conventional Chemotherapy and Targeted Anticancer Agents. Cancer Cell. 28 (6), 690-714 (2015).
  23. Muddineti, O. S., Ghosh, B., Biswas, S. Current trends in using polymer coated gold nanoparticles for cancer therapy. International Journal of Pharmaceutics. 484 (1-2), 252-267 (2015).
  24. Hu, W., et al. Methyl Orange removal by a novel PEI-AuNPs-hemin nanocomposite. Journal of Environmental Sciences. 53, 278-283 (2017).
  25. Gu, F. X., et al. Targeted nanoparticles for cancer therapy. Nano Today. 2 (3), 14-21 (2007).
  26. Srinivasarao, M., Galliford, C. V., Low, P. S. Principles in the design of ligand-targeted cancer therapeutics and imaging agents. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (3), 203-219 (2015).
  27. Liu, Z., Shi, Y., Chen, Z., Duan, L., Wang, X. Current progress towards the use of aptamers in targeted cancer therapy. Chinese Science Bulletin (Chinese Version). 59 (14), 1267 (2014).
  28. Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in delivery applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (11), 1307-1315 (2008).
  29. Vandghanooni, S., Eskandani, M., Barar, J., Omidi, Y. Antisense LNA-loaded nanoparticles of star-shaped glucose-core PCL-PEG copolymer for enhanced inhibition of oncomiR-214 and nucleolin-mediated therapy of cisplatin-resistant ovarian cancer cells. International Journal of Pharmaceutics. 573, 118729 (2020).
  30. Andghanooni, S., Eskandani, M., Barar, J., Omidi, Y. AS1411 aptamer-decorated cisplatin-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) nanoparticles for targeted therapy of miR-21-inhibited ovarian cancer cells. Nanomedicine. 13 (21), 2729-2758 (2018).
  31. Palmieri, D., et al. Human anti-nucleolin recombinant immunoagent for cancer therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9418-9423 (2015).
  32. Pichiorri, F., et al. In vivo NCL targeting affects breast cancer aggressiveness through miRNA regulation. Journal of Experimental Medicine. 210 (5), 951-968 (2013).
  33. Hou, S., McCauley, L. K., Ma, P. X. Synthesis and erosion properties of PEG-containing polyanhydrides. Macromolecular Bioscience. 7 (5), 620-628 (2007).
  34. Nie, L., et al. Injectable Vaginal Hydrogels as a Multi-Drug Carrier for Contraception. Applied Sciences. 9 (8), 1638 (2019).
  35. Zou, P., Suo, J., Nie, L., Feng, S. Temperature-responsive biodegradable star-shaped block copolymers for vaginal gels. Journal of Materials Chemistry. 22 (13), 6316-6326 (2012).
  36. Etrych, T., Šubr, V., Laga, R., Říhová, B., Ulbrich, K. Polymer conjugates of doxorubicin bound through an amide and hydrazone bond: Impact of the carrier structure onto synergistic action in the treatment of solid tumours. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 58, 1-12 (2014).
  37. Safari, F., Tamaddon, A. M., Zarghami, N., Abolmali, S., Akbarzadeh, A. Polyelectrolyte complexes of hTERT siRNA and polyethyleneimine: Effect of degree of PEG grafting on biological and cellular activity. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 44 (6), 1561-1568 (2016).

Tags

الكيمياء، العدد 160، أبتامر، الجسيمات النانوية الذهبية، الدوكسوروبيسين، كوبوليمر، تسليم الأدوية، علاج السرطان
توليف Aptamer-PEI-g-PEG الجسيمات النانوية الذهبية المعدلة المحملة بدوكسوروبيسين لتسليم الأدوية المستهدفة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nie, L., Sun, S., Sun, M., Zhou, Q., … More

Nie, L., Sun, S., Sun, M., Zhou, Q., Zhang, Z., Zheng, L., Wang, L. Synthesis of Aptamer-PEI-g-PEG Modified Gold Nanoparticles Loaded with Doxorubicin for Targeted Drug Delivery. J. Vis. Exp. (160), e61139, doi:10.3791/61139 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter