Sintesi di Nanoparticelle d'oro modificate Aptamer-PEI-g-PEG Caricate con doxorubicina per la consegna mirata di farmaci
Summary
In questo protocollo, le nanoparticelle d’oro modificate AS1411-g-PEI-g-PEG caricate con doxorubicina vengono sintetizzati tramite reazioni di ammide in tre step. Quindi, la doxorubicina viene caricata e consegnata alle cellule tumorali bersaglio per la terapia del cancro.
Abstract
A causa della resistenza ai farmaci e della tossicità nelle cellule sane, l’uso di doxorubicina (DOX) è stato limitato nella terapia clinica del cancro. Questo protocollo descrive la progettazione di poli(etilenimina) innestate con polietilene glicole (PEI-g-PEG) copolimero funzionalizzato nanoparticelle d’oro (AuNPs) con aptamero caricato (AS1411) e DOX attraverso reazioni ammide. AS1411 è specificamente legato con recettori mirati della nucleolina sulle cellule tumorali in modo che il DOX si ritrae contro le cellule tumorali anziché le cellule sane. In primo luogo, PEG viene carbossilato, quindi innestato in PEI ramificata per ottenere un copolimero PEI-g-PEG, che è confermato dall’analisi NMR 1H. Successivamente, vengono sintetizzati nanoparticelle d’oro rivestite di copolimero PEI-g-PEG@AuNPs) e DOX e AS1411 sono covalentemente legati agli AuNP gradualmente attraverso reazioni ammide. Il diametro dell’AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs preparato è di ~39,9 nm, con un potenziale zeta di -29,3 mV, indicando che le nanoparticelle sono stabili in acqua e mezzo cellulare. I test di citotossicità cellulare mostrano che gli AuNP caricati da DOX di nuova progettatezza sono in grado di uccidere le cellule tumorali (A549). Questa sintesi dimostra la delicata disposizione di copolimeri, aptameri e DOX PEI-g-PEG sugli AuRP che si ottengono con reazioni sequenziali di ammide. Tali ADUL funzionalizzati aptamer-PEI-g-PEG forniscono una piattaforma promettente per la somministrazione mirata di farmaci in terapia oncologica.
Introduction
Essendo il principale problema di salute pubblica in tutto il mondo, il cancro è ampiamente caratterizzato come avente un basso tasso di cura, un alto tasso di recidiva e un alto tassodi mortalità 1,2. Gli attuali metodi anti-cancro convenzionali includono chirurgia, chemioterapia e radioterapia3, tra cui la chemioterapia è il trattamento primario per i pazienti oncologici nella clinica4. I farmaci antitumorali usati clinicamente includono principalmente paclitaxel (PTX)5 e doxorubicina (DOX)6,7. Dox, un farmaco antineoplastico, è stato ampiamente applicato nella chemioterapia clinica, a causa dei vantaggi della citotossicità del cancro e dell’inibizione della proliferazione delle celluletumorali 8,9. Tuttavia, DOX causa cardiotossicità 10,11e la breve emiprotezione di DOX ne limita l’applicazione nella clinica12. Pertanto, i portatori di farmaci degradabili sono necessari per caricare DOX e rilasciare in modo sottoequente in modo controllato in un’area mirata.
Le nanoparticelle sono state ampiamente utilizzate in sistemi mirati di somministrazione di farmaci e hanno diversi vantaggi nel trattamento del cancro (ad esempio, rapporto superficie/volume bilmente ridotto, piccole dimensioni, capacità di incapsulare vari farmaci e chimica delle superfici tonnibili, ecc.) 13,14,15. In particolare, le nanoparticelle d’oro (AuNPs) sono state ampiamente utilizzate in applicazioni biologiche e biomediche, come la terapia del cancro fototermico16,17. Le proprietà uniche degli AuNP, come la facile sintesi e la funzionalizzazione generale della superficie, hanno ottime prospettive nel campo clinico della terapia del cancro18. Inoltre, gli AuNP sono stati utilizzati per identificare le strategie di somministrazione dei farmaci, diagnosticare i tumori e superare la resistenza inmolti studi 19,20.
Nonostante ciò, gli AuRP devono essere ulteriormente personalizzati per superare la resistenza ai farmaci attraverso un elevato rilascio locale di lesioni tumorali attraverso una maggiore permeazione e ritenzione (EPR), come le proprietà di targeting e accessibilità. Gli AuRP funzionalizzati polimerici hanno mostrato vantaggi unici, come una migliore solubilità in acqua dei farmaci anticancro idrofobici e un tempo di circolazioneprolungato 21,22. Vari polimeri biocompatibili sono stati utilizzati per rivestimenti AuNP, come polietilene glicole (PEG), polietileneimina (PEI), acido ialuronico, eparina e gomma di xantano. Quindi la stabilità, così come il carico utile, degli AuNP è migliorata ben23. In particolare, pei è un polimero altamente ramificato composto da molte unità ripetute di ammine primarie, secondarie e terziarie24. PEI ha un’eccellente solubilità, bassa viscosità e un alto grado di funzionalità, adatto per il rivestimento su AuNPs.
D’altra parte, i farmaci anti-cancro devono essere consegnati alle cellule tumorali direttamente con una migliore efficienza di carico e con una minore tossicità per il trattamento dei tumori metastatici primari eavanzati 25. I ligandi mirati hanno un grande potenziale per i sistemi di somministrazione mirati ai farmaci anti-cancro26. La sua selettività per il legame con molecole bersaglio conferisce un farmaco anti-cancro mirato alla specificità e aumenta l’arricchimento dei farmaci nei tessutimalati 27. Altri ligandi includono anticorpi, polipeptidi e piccole molecole. Rispetto ad altri ligandi, gli aptameri di acido nucleico possono essere sintetizzati in vitro e sono facili da modificare. AS1411 è un oligonucleotide fosfodiestere da 26 bp non modificato che forma una struttura G-tetramero dimerica stabile per legarsi specificamente a un recettore delle proteine nucleari bersaglio sovraespressosulle cellule tumorali 28,29,30. AS1411 inibisce la proliferazione di molte cellule tumorali ma non influisce sulla crescita delle cellulesane 31,32. Di conseguenza, AS1411 è stato utilizzato per fabbricare un sistema di somministrazione di farmaci mirato ideale.
In questo studio, un copolimero PEI-g-PEG viene sintetizzato attraverso una reazione ammide, quindi vengono fabbricate nanoparticelle d’oro rivestite di copolimero PEI-g-PEG (PEI-g-PEG@AuNPs). Inoltre, DOX e AS1411 sono collegati in sequenza al pei-g-PEG@AuNPs preparato, come illustrato nella figura 1. Questo protocollo dettagliato ha lo scopo di aiutare i ricercatori a evitare molte delle insidie comuni associate alla fabbricazione di nuovi PEI-g-PEG@AuNPs caricati con DOX e AS1411.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo spettro 1H NMR (Figura 2) conferma la sintesi riuscita del copolimero CT-PEG e del copolimero PEI-g-PEG. I pesi molecolari di PEG e PEI erano rispettivamente 1.000 e 1.200. Inoltre, il sistema catalitico EDC/NHS è stato utilizzato per sintetizzare il copolimero PEI-g-PEG attraverso reazioni di ammide. Va notato che se i pesi molecolari di PEG e PEI sono cambiati per sintetizzare il copolimero PEI-g-PEG, allora il tempo di reazione e il sistema catalitico devono essere rivaluta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata finanziata dalla National Natural Science Foundation of China (31700840); il Progetto chiave di ricerca scientifica della provincia di Henan (18B430013, 18A150049). Questa ricerca è stata supportata dal Nanhu Scholars Program for Young Scholars of XYNU. Gli autori vorrebbero ringraziare lo studente di laurea Zebo Qu del College of Life Sciences di XYNU per le sue utili opere. Gli autori vorrebbero riconoscere il Centro analisi & test di XYNU per l’uso delle loro apparecchiature.
Materials
| 4-Dimethylaminopyridine | Macklin | D807273 | |
| A549 cell | ATCC CCL-185TM | ||
| AS1411 | BBI Life Sciences Corporation | 5'-d (TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG) FL-AS1411 (fluorophore-labeled AS1411) | |
| Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) | SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd | ||
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Sigma Aldrich | 96992-500TESTS-F | |
| Dichloromethane | Traditional Chinese medicine | 80047318 | |
| Diethyl ether (Et2O) | SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd | ||
| Dimethyl sulfoxide | Macklin | D806645 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Sigma Aldrich | ||
| Doxorubicin hydrochloride | Rhawn | R017518 | |
| Ether absolute | Traditional Chinese medicine | 80059618 | |
| Field Emission Transmission Electron Microscope | FEI Company | Tecnai G2 F 20 | |
| Gold(III) chloride trihydrate | Rhawn | R016035 | |
| Laser Particle-size Instrument | Malvern Instruments Ltd | ZetasizerNanoZS/Masterszer3000E | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride | Macklin | N808856 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Macklin | H6231 | |
| NMR software | Delta 5.2.1 | ||
| Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer | JEOL | JNM-ECZ600R/S3 | |
| Origin 8.5 | OriginLab | ||
| Penicillin | Sigma Aldrich | V900929-100ML | |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma Aldrich | 81188 | BioUltra, average Mn ~ 1000 |
| Poly (ethyleneimine) solution | Sigma Aldrich | 482595 | average Mn ~ 1200, 50 wt.% in H2O |
| Sodium borohydride, powder | Acros | C18930 | |
| Streptomycin | Sigma Aldrich | 85886-10ML | |
| Succinic anhydride | Traditional Chinese medicine | 30171826 | |
| Tetrahydrofuran | Traditional Chinese medicine | 40058161 | |
| Triethylamine | Traditional Chinese medicine | 80134318 | |
| UV/VIS/NIR Spectrometer | Lambda950 | Lambda950 | |
| X-ray Photoelectron Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | K-ALPHA 0.5EV |
References
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