Summary
Bu protokolde, doxorubicin yüklü AS1411-g-PEI-g-PEG modifiye altın nanopartiküller üç aşamalı reaksiyonlar yoluyla sentezlenir. Daha sonra doksofobikin yüklenir ve kanser tedavisi için hedef kanser hücrelerine teslim edilir.
Abstract
Sağlıklı hücrelerde ilaç direnci ve toksisite nedeniyle klinik kanser tedavisinde doksofobisin (DOX) kullanımı sınırlanmıştır. Bu protokol, polietilen glikol (PEI-g-PEG) koaloksimer fonksiyonelleştirilmiş altın nanopartiküller (AuNP'ler) ile aşılanmış poli (etileninimin) yüklü aptamer (AS1411) ve DOX ile amid reaksiyonları yoluyla tasarlanmasını açıklar. AS1411 özellikle kanser hücrelerindeki hedefli nükleolin reseptörleri ile bağlanır, böylece DOX sağlıklı hücreler yerine kanser hücrelerini hedefler. İlk olarak, PEG karboksilatlanır, daha sonra 1H NMR analizi ile onaylanan bir PEI-g-PEG koalizör elde etmek için dallı PEI'ye aşılanır. Daha sonra, PEI-g-PEG koalizör kaplı altın nanopartiküller (PEI-g-PEG@AuNPs) sentezlenir ve DOX ve AS1411, reaksiyonlar arasında yavaş yavaş AuNP'lere bağlanır. Hazırlanan AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs çapı ~39,9 nm dir ve nanopartiküllerin su ve hücre ortamında stabil olduğunu gösteren -29,3 mV zeta potansiyeline sahiptir. Hücre sitotoksikliği tahlilleri, yeni tasarlanan DOX yüklü AuNP'lerin kanser hücrelerini (A549) öldürebildiğini göstermektedir. Bu sentez, PEI-g-PEG koalizörlerinin, aptamerlerinin ve DOX'un, sıralı amid reaksiyonları ile elde edilen AuNP'ler üzerindeki hassas düzenini göstermektedir. Bu tür aptamer-PEI-g-PEG fonksiyonelleştirilmiş AuNP'ler kanser tedavisinde hedefe yönelik ilaç teslimatı için umut verici bir platform sağlar.
Introduction
Dünya çapında en büyük halk sağlığı sorunu olan kanser, düşük kür oranı, yüksek nüks oranı ve yüksek ölüm oranı1,2. Mevcut konvansiyonel kanser karşıtı yöntemler cerrahi, kemoterapi ve radyoterapi3, kemoterapinin klinikteki kanser hastaları için birincil tedavi olduğu4. Klinik olarak kullanılan antikanser ilaçlar esas olarak paclitaxel (PTX)5 ve doxorubicin (DOX)6,7içerir. Bir antineoplastik ilaç olan DOX, kanser sitotoksisitesi ve kanser hücre çoğalmasının inhibisyonu avantajları nedeniyle klinik kemoterapide yaygın olarak uygulanmıştır8,9. Bununla birlikte, DOX kardiyotoksiteye neden olur10,11ve DOX'un kısa yarı ömrü klinikte uygulanmasını kısıtlar12. Bu nedenle, DOX'i yüklemek ve kontrollü bir şekilde hedeflenen bir alana serbest bırakmak için bozulabilir ilaç taşıyıcılarına ihtiyaç vardır.
Nanopartiküller hedefli ilaç dağıtım sistemlerinde yaygın olarak kullanılmaktadır ve kanser tedavisinde çeşitli avantajlara sahiptir (yani, büyük yüzey-hacim oranı, küçük boyut, çeşitli ilaçları kapsülleme yeteneği ve ayarlanabilir yüzey kimyası vb.) 13,14,15. Özellikle, altın nanopartiküller (AuNP'ler) fototermal kanser tedavisi16,17gibi biyolojik ve biyomedikal uygulamalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. AuNP'lerin facile sentezi ve genel yüzey fonksiyonelleştirme gibi benzersiz özellikleri, kanser tedavisinin klinik alanında mükemmel beklentilere sahiptir18. Ayrıca, AuNP'ler ilaç dağıtım stratejilerini tanımlamak, tümörleri teşhis etmek ve birçok çalışmada direnci yenmek için kullanılmıştır19,20.
Buna rağmen, AuNP'lerin, hedefleme ve erişilebilirlik özellikleri gibi gelişmiş geçirgenlik ve tutma (EPR) yoluyla tümör lezyonlarında yüksek lokal salınım yoluyla ilaç direncinin üstesinden gelmek için daha fazla uyarlanması gerekir. Polimer fonksiyonelleştirilmiş AuNP'ler, hidrofobik antikanser ilaçlarının iyileştirilmiş su çözünürlüğü ve uzun sirkülasyon süresi21,22gibi benzersiz avantajlar sergilemiştir. AuNP kaplamaları için polietilen glikol (PEG), polietilenimin (PEI), hyaluronik asit, heparin ve ksantan sakızı gibi çeşitli biyouyumlu polimerler kullanılmıştır. Daha sonra AuNP'lerin stabilitesi ve yükü iyileştirildi23. Özellikle, PEI, birincil, ikincil ve üçüncül aminlerin24'ünbirçok tekrarlayan biriminden oluşan yüksek dallı bir polimerdir. PEI mükemmel çözünürlüğe, düşük viskoziteye ve AuNP'lerde kaplama için uygun olan yüksek derecede işlevselliğe sahiptir.
Öte yandan, anti-kanser ilaçlarının doğrudan kanser hücrelerine daha iyi yükleme verimliliği ve primer ve ileri metastatik tümörlerin tedavisi için daha düşük toksisite ile teslim edilmesi gerekir25. Hedeflenen ligandlar anti-kanser ilaç hedefli doğum sistemleri için büyük bir potansiyele sahiptir26. Hedef molekül bağlama için seçiciliği, özgüllüğü hedefleyen kanser önleyici ilaçlar ve hastalıklı dokularda ilaç zenginleştirmeyi arttırır27. Daha fazla ligand antikorlar, polipeptitler ve küçük moleküller içerir. Diğer ligandlara kıyasla, nükleik asit aptamerleri in vitro olarak sentezlenebilir ve değiştirilmesi kolaydır. AS1411, özellikle kanser hücreleri 28,29,30üzerinde aşırı ifade edilmiş bir hedef nükleer protein reseptörüne bağlanmak için kararlı bir dimerik G-tetramer yapısı oluşturan değiştirilmemişbir 26bp fosfodiester oligonükleotiddir. AS1411 birçok kanser hücresinin çoğalmasını engeller, ancak sağlıklı hücrelerin büyümesini etkilemez31,32. Sonuç olarak, AS1411 ideal bir hedefli ilaç dağıtım sistemi imal etmek için kullanılmıştır.
Bu çalışmada, bir PEI-g-PEG koalolymer amid reaksiyonu ile sentezlenir, daha sonra PEI-g-PEG koalolymer kaplı altın nanopartiküller (PEI-g-PEG@AuNPs) imal edilir. Ayrıca, DOX ve AS1411, Şekil 1'degösterildiği gibi, hazırlanan PEI-g-PEG@AuNPs ardışık olarak bağlanır. Bu ayrıntılı protokol, araştırmacıların DOX ve AS1411 yüklü yeni PEI-g-PEG@AuNPs üretimiyle ilgili ortak tuzakların çoğundan kaçınmalarına yardımcı olmak için tasarlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
DİkKAT: Tüm kimyasalları kullanmadan önce ilgili tüm malzeme güvenliği veri sayfalarına (MSDS) başvurduğunuzdan emin olun. Koalyolimer ve nanopartiküllerin hazırlanmasında kullanılan kimyasalların birçoğu akut olarak toksiktir. Nanopartiküllerin de potansiyel tehlikeleri vardır. Eldivenler, laboratuvar önlüğü, davlumbazlar, tam boy pantolonlar ve yakın kullanımlı ayakkabılar da dahil olmak üzere tüm uygun güvenlik uygulamalarını ve kişisel koruyucu ekipmanları kullandığınızdan emin olun.
1. Çift karboksil polietilen glikol sentezi (CT-PEG)33
- 100 mL yuvarlak alt şişeye 1,46 g (14,6 mmol) süksinik anhidrit (SA) ve 4-dimetilamipikopyridin (DMAP) 209 mg (1,71 mmol) ekleyin.
- 1.1. adımda kullanılan mataraya 15 mL susuz tetrahidrofuran (THF) ekleyin ve bir cam durdurucu takın. Matarayı 0 °C'de 30 dakika tutun.
- Yeni bir şişeye 4,28 g (4,28 mmol) polietilen glikol (PEG) ve 1,8 mL (12,8 mmol) trietilen (TEA) ekleyin.
- 1.3. adımda kullanılan mataraya 15 mL susuz THF ekleyin ve bir cam durdurucu takın. Çözeltiyi, azot atmosferi altında bir şırınna kullanarak 1.2 adımında kullanılan şişeye yavaşça aktarın.
- Çözeltiyi 0 °C'de 2 saat karıştırın, ardından reaksiyona oda sıcaklığında (RT) gece boyunca devam edin.
- Döner evaporatör (40 °C, 0,1 MPa) kullanarak reaksiyon çözeltisini konsantre edin ve THF çözücüyü çıkarın.
- RT'de, reaksiyon çözeltisini 1.325 g/mL dikloromethanenin (DCM) 15 mL'sinde 1.6 adımından çözün, ardından çökeltme ürününü (polietilen glikol diacid) elde etmek için 15 mL soğuk dietil eter (Et2O) ekleyin. Çözücüyü filtre kağıdı ile çıkarın.
NOT: Yağış adımı 3x tekrarlanabilir. - Çökelticileri RT'de vakum altında 48 saat kurutun.
2. PEI-g-PEG koalolimer sentezi
- 1.8 ve 5 mL dimetil sülfit (DMSO) adımından bir şişeye 305.47 mg CT-PEG ekleyin ve CT-PEG'in DMSO'da tamamen çözüldüğünden emin olmak için RT'de karıştırın.
- 49,46 mg 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidroklorür (EDC) 5 mL DMSO çözün, sonra 2.1 adımda kullanılan şişeye çözelti ekleyin ve RT'de 30 dakika karıştırın.
- 29,69 mg N-hidroksisuçinid (NHS) 5 mL DMSO'da çözün ve çözeltiyi adım 2.1'de kullanılan şişeye ekleyin. RT'de 3 saat karıştırmaya devam edin.
- 28,6 μL polietileniminin (PEI) 10 mL DMSO'da çözün ve çözeltiyi adım 2,1'de kullanılan şişeye damla yönünde ekleyin. En az 3 gün karıştırın.
- Reaksiyona giren çözeltiyi adım 2.4'ten diyaliz torbasına (1.000 moleküler ağırlık kesme [MWCO]) aktarın. Diyaliz torbasını kadran olarak 500 mL ultra saf su ile 1 L beher içine yerleştirin. Ultra saf suyu 3 gün boyunca her 12 saat değiştirin.
- 2.5. adımdaki çözeltiyi başka bir diyaliz torbasına (10.000 MWCO) aktarın. Diyaliz torbasını kadran olarak 500 mL ultra saf su ile 1 L beher içine yerleştirin. Ultra saf suyu 3 gün boyunca her 12 saat değiştirin.
- Çözeltiyi 2.6.
3. PEI-g-PEG@AuNPs Sentezi
- 5 mg hazırlanmış PEI-g-PEG'i (adım 2.7) 5 mL ultra saf suda yeni bir şişede çözün ve bir cam durdurucuya takın.
- Mataraya 100 mL 0,3 mM HAuCl4 çözeltisi ekleyin ve çözümü RT'de 3 saat karıştırın.
NOT: Çözeltinin rengi hemen sarıdan turuncuya değişmelidir. - Şişeye 1 mL 1 mg/mL NaBH4 çözeltisi ekleyin ve rt'de çözeltiyi 3 saat karıştırın.
NOT: Reaksiyon çözeltisi anında bordoya dönmelidir. - PEI-g-PEG@AuNPs çözeltisini elde etmek için 2.5 adımında açıklandığı gibi 3 gün boyunca bir diyaliz torbası (1.000 MWCO) kullanarak reaksiyon ürününü dialyze edin.
4. DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs sentezi
- Yeni bir şişeye 1 mL 2,2 mg/mL DOX çözeltisi ve 20 mL PEI-g-PEG@AuNPs çözeltisi ekleyin ve cam bir durdurucuya takın.
- 1 mL ultra saf suda 0.727 mg EDC çözün ve EDC çözeltisini adım 4.1'de kullanılan şişeye ekleyin.
- 0.437 mg NHS'yi 1 mL ultra saf suda çözün. NHS çözeltisini şişeye ekleyin ve RT'de 1 saat karıştırın.
- DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs çözümünü elde etmek için 2.5.
5. AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs sentezi
- Yeni bir şişeye 20 mL DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs çözeltisi ve 4OD AS1411 (OD = optik yoğunluk; 1OD ≈ 33 μg) ekleyin.
- 28,76 mg EDC'yi 1 mL ultra saf suda çözün ve 5.1 adımında kullanılan şişeye EDC çözeltisini ekleyin.
- 17,27 mg NHS'yi 1 mL ultra saf suda çözün. 5.1. adımda kullanılan mataraya NHS solüsyonünü ekleyin ve RT'de reaksiyonun 1 saat karıştırın.
- AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs elde etmek için 2.5.
6. Örnek karakterizasyon
- CT-PEG polimerini (adım 1.8) ve PEI-g-PEG koalolymerini (adım 2.7) sırasıyla nükleer manyetik rezonans (NMR) tüplerinde kloroform-d olarak çözün. Kimyasal yapıyı doğrulamak için 14,09 T süper iletken mıknatıs ve 5,0 mm 600 MHz geniş bant Z-gradyan yüksek çözünürlüklü prob ile donatılmış 600 MHz NMR spektrometre kullanarak numuneleri analiz edin34.
- AuNP'leri, DOX'u ve AS1411'i dağıtıp ultra saf suda sırasıyla PEI-g-PEG@AuNPs (adım 3.4), DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (adım 4.4) ve AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (adım 5.4) hazırlayın. Ardından, cuvettes aktarın ve bir UV-vis spektrofotometre kullanarak ultraviyole görünür (UV-vis) spektrumu kaydedin.
- Alüminyum folyoya çift taraflı bir yapıştırıcı (~2 mm x 2 mm) takın ve numune çözeltisini (PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs ve AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs) tüm bant üzerine eşit şekilde batırın. X-ışını fotoelektron spektroskopisi analizörü kullanarak numuneleri analiz edin.
- ULTRA SAF SUDA PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs ve AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs çözeltilerini sırasıyla dağıtin. Ardından, cuvettes aktarın ve dinamik ışık saçılım kullanarak boyut dağılımını değerlendirin.
- PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs ve AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs çözeltilerini ultra saf suya dağıtın (her numune için 5 mL ultra saf su başına bir damla numune). 2 saat boyunca sonicate. Bakır ızgarayı numune çözeltilerine batırın ve kızılötesi lambanın altında kurutun. İletim elektron mikroskobu kullanarak morfolojiyi karakterize edin.
- 20 kDa MWCO diyaliz kasetine 1 mg AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs enjekte edin, ardından % 5 sığır serum albümini (BSA) ile 80 mL fosfat tamponlu salin (PBS) yerleştirin. 37 °C'de karıştırın.
- Önceden belirlenmiş zaman noktalarında, 100 μL aliquots toplayın ve taze PBS ile değiştirin. Aliquotların DOX floresan yoğunluğunu ölçmek için bir UV-vis spektrofotometre kullanın.
7. AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs nanopartiküllerinin CCK-8 tahlilleri
- Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium'unda (DMEM) %10 fetal sığır serumu, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile desteklenmiş A549 hücrelerini %95 hava ve %5 CO2 ile 37 °C'de nemlendirilmiş bir atmosfer altında büyütün. Kültür ortamını her 2 günde bir değiştirin. Hazırlanan AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs nanopartiküllerinin sitotoksisitesini nicel olarak değerlendirmek için hücre çoğalması ve sitotoksiklik tahlilleri için 5.
- Her kuyuya 1 mL hücre ortamı içeren 100 μL nanopartikül çözeltisi ekleyin. 24 saat ve 48 saat kültleme yaptıktan sonra, kültür medyasını hücre kültürü plakalarından çıkarın, ardından her kuyuya hemen 300 μL taze kültür ortamı ve 30 μL hücre sayım kiti-8 (CCK-8) kiti çözümleri ekleyin. 37 °C'de bir CO 2 inkübatörde4 saat kuluçkaya yatırın.
- 200 μL reaksiyon çözümlerini adım 7.2'den 96 kuyu plakasına aktarın. Mikro plaka okuyucu ile 570 nm'de her kuyunun optik yoğunluğunu (OD) okuyun.
- Mikroskop altında 24 saat ve 48 saat hücre morfolojisini gözlemleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1 CT-PEG polimer ve PEI-g-PEG koalolimerlerinin başarılı sentezini doğrulamak için H NMR spektroskopisi kullanılmıştır (Şekil 2). Şekil 2a, δ 'daki metilen proton sinyalinin = 3.61 ppm'de ve δ ' de karboksil proton sinyalinin = 2.57 ppm'de CT-PEG polimerlerinin başarılı sentezini doğruladığını göstermektedir. Şekil 2b, PEG'in δ =2.6 ppm'deki metilen proton sinyalinin ve δ 'daki PEI proton sinyalinin = 1.66 ppm'de PEI-g-PEG koalolimerlerinin sentezini doğruladığını göstermektedir.
Hazırlanan koalyolimerin AuNP'lerde başarılı bir şekilde işlevselleştirilmesini belirlemek için UV-vis spektroskopisi yapılmıştır(Şekil 3). UV-vis spektrumlarında, bantların ~523 nm, 507 nm ve 260 nm'deki varlığı, sırasıyla AuNP, DOX ve AS1411'in yüzey plazmon rezonansı (SPR) zirvelerine karşılık gelir (Şekil 3a). PEI-g-PEG@AuNPs UV-vis spektrumunda ~360 nm'deki bantlar, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs UV-vis spektrumunda ~532 nm ve AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs UV-vis spektrumunda ~546 nm, AuNP'lere bağlı PEI-g-PEG koalolimerlerinin başarılı sentezini doğrular. Ayrıca DOX ve AS1411'in işlevselleştirilmiş AuNP'lere yavaş yavaş yüklendiğini doğrularlar (Şekil 3b).
AuNP'lerdeki kokolimer kimyasal bağını araştırmak için X-ışını fotoelektron spektroskopisi (XPS) kullanılmıştır (Şekil 4). PEI-g-PEG@AuNPs XPS spektrumu C1'leri, O1'leri, N1'leri ve Au4f zirvelerini gösterdi, AuNP'ler ve PEI-g-PEG koalolymer arasındaki bağlantıyı gösterdi (Şekil 4a). DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs XPS spektrumunda küçük bir değişiklik oldu, çünkü DOX PEI-g-PEG@AuNPs daha fazla aşılandı (Şekil 4b). Ayrıca, AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs için P2p zirvesinin ortaya çıkması esas olarak DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs'de AS1411'in başarılı grefti nedeniyledir (Şekil 4c). Hazırlanan nanopartiküllerin boyut dağılımı DLS kullanılarak analiz edildi (Şekil 5). PEI-g-PEG@AuNPs ile karşılaştırıldığında, ortalama hidrasyon çapı DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs'de biraz arttı ve AS1411 aşılandıktan sonra daha da arttı.
TEM nanopartiküllerin morfolojisini belirlemek için kullanıldı ve görüntüler tüm nanopartiküllerin toplama olmadan tekdüze olduğunu gösterdi (Şekil 6). AuNP'lerin yüzeyindeki koalyler arasındaki etkileşimler nedeniyle, AuNP'lerin mesafesi giderek arttı. Hazırlanan DOX dağıtım sisteminin hedef özelliğini belirlemek için hücre canlılığı testi kullanılmıştır (Şekil 7 ve Şekil 8). CCK-8 sonuçları(Şekil 7)1) A549 hücre sayısının zaman içinde AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs ile kültlendikten sonra azaldığını ve 2) nanopartikül konsantrasyonunun artmasıyla hücre sayısının azaldığını göstermiştir. Serbest DOX grubuna kıyasla, hücre sayısı artarak toksisitenin azaldığını gösterdi.
Optik mikroskopi görüntüleri ile birlikte (Şekil 8), sonuçlar AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (Şekil 8a−d) ile kültleştikten sonra nanopartikül eklemeden kontrol grubuna kıyasla hücre sayısının azaldığını göstermektedir (Şekil 8e,f). Ayrıca PBS'de hazırlanan AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs dox çıkış profili araştırılmıştır(Şekil 9). Sonuçlar, DOX'un fonksiyonelleştirilmiş nanopartiküllerden sürekli salındığının A549 hücrelerinde azalmaya neden olduğunu ve kümülatif DOX salınımının yaklaşık% 63.5 ± 72 saat içinde% 3.2 olduğunu göstermektedir.
Şekil 1: PEI-g-PEG@AuNP, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNP ve AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNP sentezinin şematik gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: 1H NMR spektrası (a) sentezlenmiş CT-PEG polimer ve (b) PEI-g-PEG koalolymer. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: (a) AuNPs, DOX ve AS1411'in UV-vis spektrumu ve (b) PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs ve AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: (a) PEI-g-PEG@AuNPs, (b) DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs ve (c) AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs'nin XPS spektrumları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs ve AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs boyut dağılımı.
d.nm = nanopartikül ortalama çapı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: (a) PEI-g-PEG@AuNPs, (b) DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs ve (c) AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs TEM görüntüleri.
Ölçek çubukları = 50 nm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Sırasıyla 24 saat ve 48 saat boyunca AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (220 μg/mL ve 110 μg/mL) ile kültlendikten sonra A549 hücrelerinin570nm'sinde (OD 570) optik yoğunluk değerleri.
Serbest DOX'a sahip hücreler ve nanopartiküller eklemeden hücreler kontrol grubu olarak dahil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: 220 μg/mL'de AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs ile kültlemeden sonra A549 hücrelerinin optik mikroskobik görüntüleri (a,b) ve 110 μg/ml (c,d) veya 24 saat (üst paneller) ve 48 h 'de (alt paneller) kontrol grubu (e,f) olarak nanopartiküller eklemeden kültleme. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: DOX'un PBS'deki AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs'dan 72 saat boyunca serbest bırakma profili. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1H NMR spektrumu (Şekil 2) CT-PEG koalolimer ve PEI-g-PEG koalolimerinin başarılı sentezini doğrular. PEG ve PEI'nin moleküler ağırlıkları sırasıyla 1.000 ve 1.200'dir. Ek olarak, EDC/NHS katalitik sistemi, PEI-g-PEG koalolymer'ı amid reaksiyonları yoluyla sentezlemek için kullanılmıştır. PEI-g-PEG koalizatör sentezlemek için PEG ve PEI'nin moleküler ağırlıkları değiştiyse, reaksiyon süresinin ve katalitik sistemin yeniden değerlendirilmesi gerektiği belirtilmelidir. Ayrıca, AuNP'ler üzerindeki PEI-g-PEG koalolymer kaplama için reaksiyon durumunun daha fazla ayarlanması gerekir, çünkü PEG-g-PEI koalizatörün molekül ağırlığı ve yapısı AuNP'lerin kaplama verimliliğini ve çapını etkileyebilir. Daha sonra, koalizer fonksiyonelleştirilmiş AuNP'lerin morfolojisi de değiştirilebilir. PEI polimerinden gelen amino grupların sayısı nihai PEI-g-PEG koalolimer sentezinin yapısını etkileyebilir ve PEI ile CT-PEG arasındaki çapraz bağlantı eylemi kaçınılmaz olarak gerçekleşecektir. Bu nedenle, adım 2.4'ün dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmesi ve PEI çözümünün yavaşça damla damla eklenmesi gerekir. Sentez reaksiyonından sonra çapraz bağlı koalizör ve yayınlanmamış polimerleri çıkarmak için diyalizin (adım 2.5 ve 2.6) çalıştırılması gerekir.
Ayrıca, DOX ve AS1411, PEI-g-PEG@AuNPs'de amid reaksiyonları yoluyla ardışık olarak işlevsel hale getirilir ve EDC/NHS katalitik sistemi kullanılır. Burada her reaksiyon için 3 gün (adım 4.3 ve adım 5.3) gerekir; ancak reaksiyon süresi 3 günden az sürerse fonksiyonelleştirme verimliliği düşecektir. 3 günden fazla süre gerektiğinde, aynı sonuç elde edilmiştir. Kimyasal EDC, NHS ve bağlantısız DOX veya AS1411'in diyaliz tedavisi ile çıkarabileceği belirtilmelidir (adım 4.4 ve adım 5.4). UV-vis spektrumu ve XPS, kokolimerin nanopartiküller üzerinde başarılı işlevselleşmesini araştırmak için etkili yöntemlerdir ve tutarlı sonuçlar elde edilmiştir (Şekil 3 ve Şekil 4).
AuNP' lerin karakteristik UV-vis bantlarından farklı olarak, DOX ve AS1411, PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs ve AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs'in benzersiz zirvelerinin, her tepenin üst üste binmesi nedeniyle gözlem yapılması zordur. Ayrıca, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (önce DOX-g-PEI-g-PEG sentezlemek ve AuNP'lerde işlevselleştirmenin başarısını sentezlemek) için farklı bir yöntem gerçekleştirdik; ancak, böyle bir yaklaşım kullanan altın nanopartiküller düşük DOX yükleme verimliliğine yol açmıştır35,36. Bu nedenle, bu çalışmada DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs sentezi yönteminin yeterli bir DOX yükleme verimliliğinin yanı sıra daha fazla serbest bırakma profili sağlayacağı belirtilmelidir. Bir deney altın nanopartiküllerin DOX yükleme verimliliğini dikkate almazsa, AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs elde etmek için başka yöntemler de vardır. Bunlar arasında dox-g-PEI-g-PEG veya AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG sentezi önce amid reaksiyonu yoluyla, daha sonra altın nanopartiküllerde işlevselleştirme sayılması saydır. Böylece, burada kullanılan yöntem ve elde edilen koalizerler doku mühendisliği gibi çeşitli tıbbi uygulamalara uygulanabilir.
Hazırlanan nanopartiküllerin boyut dağılımı ve morfolojisi DLS ve TEM tarafından araştırılabilir. DLS verileri (Şekil 5) hidrasyon çapı nanopartiküllerinin farklı kaplamalardan farklılık gösterdiğini ve her numune için birden fazla tepe noktasının göründüğünü göstermektedir. PEI-g-PEG yapısı ile ilgili olarak (Şekil 1), DLS'nin normal dağılım eğrisi gözlenmez. Nanopartiküllerin DLS testi sırasında ultra saf suda dağıldığı, nanopartiküllerin yüzeyindeki koalyler arasındaki etkileşimler nedeniyle farklı hacim oranlarının kullanıldığı ve çok tepelilerin hala mevcut olduğu belirtilmelidir. Böylece, TEM görüntüleri nanopartiküllerin morfolojisini doğrulamak için kullanılır. PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs ve AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs TEM görüntüleri Şekil 6'dagösterilmiştir.
Altın nanopartiküllerin yüzeylerinin farklı bileşenlerine dayanarak, nanopartiküller arasındaki mesafeler değişir. Ayrıca, suya dağılmış hazırlanan nanopartiküller zeta potansiyel testlerine göre stabildir (zaman testlerinden sonra farklı nanopartiküller için -29 ila 50 mV). DOX ve AS1411'in daha fazla işlevselleştirilmesi (protokolün 4. ve 5. bölümleri) altın nanopartiküllerin çapını etkilemez. UV-vis'in tüm test yöntemlerini kullanmadan nanopartiküllere yüklenen DOX ve AS1411'i doğrulamak için etkili bir yöntem olduğu sonucuna varılabilir.
Kanser hücreleri üzerindeki hedeflenen özellik, farklı konsantrasyonlarda hazırlanmış AS1411 ve DOX yüklü AuNP'lerle kültürlenmiş A549 hücreleri kullanılarak ve kontrol grubu olarak nanopartiküller eklenerek araştırılmıştır. Aynı zamanda, ücretsiz DOX'un A549 hücre canlılığı üzerindeki etkileri de test edildi (Şekil 7 ve Şekil 8). Nanopartikül eklemeden gruba kıyasla, hazırlanan AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs A549 hücrelerinde azalmaya yol açar. Bununla birlikte, nanopartiküllerin konsantrasyonu azalırken (100 μg / mL), hücreler serbest DOX grubuna kıyasla 24 saat daha iyi aktivite gösterir. Bunun başlıca nedeni PEI-g-PEG kokolimerinin mükemmel sitocompatibility37'ye sahip olması ve dallı PEI polimerinin spesifik olmayan toksisitesinin iyileştirilmiş olmasıdır.
Son olarak aptamer AS1411'in hedeflenen özelliği nedeniyle elde edilen nanopartiküller sağlıklı hücreler yerine kanser hücrelerinde birikir. Aptamer tanındıktan sonra, DOX kanser hücrelerini öldürmek için serbest bırakılır. PBS'deki AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs'den DOX'un yayın profili kaydedildi (Şekil 9). Bu protokol, koalimyalı modifiye AuNP'lere çok aşamalı bir reaksiyon yoluyla aşılanmış aptamerler ve DOX hazırlamak için bir yaklaşım göstermektedir. Sentezlenen nanopartiküller kanser tedavisi uygulamaları için potansiyele sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu araştırma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31700840) tarafından finanse edildi; Henan Eyaleti'nin Temel Bilimsel Araştırma Projesi (18B430013, 18A150049). Bu araştırma, XYNU'nun Genç Bilginleri için Nanhu Bursiyerleri Programı tarafından desteklendi. Yazarlar, XYNU'daki Yaşam Bilimleri Koleji'nden lisans öğrencisi Zebo Qu'ya yardımcı çalışmaları için teşekkür ediyor. Yazarlar, ekipmanlarının kullanımı için XYNU Analiz ve Test Merkezi'ni kabul etmek isterler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Dimethylaminopyridine | Macklin | D807273 | |
| A549 cell | ATCC CCL-185TM | ||
| AS1411 | BBI Life Sciences Corporation | 5'-d (TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG) FL-AS1411 (fluorophore-labeled AS1411) | |
| Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) | SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd | ||
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Sigma Aldrich | 96992-500TESTS-F | |
| Dichloromethane | Traditional Chinese medicine | 80047318 | |
| Diethyl ether (Et2O) | SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd | ||
| Dimethyl sulfoxide | Macklin | D806645 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Sigma Aldrich | ||
| Doxorubicin hydrochloride | Rhawn | R017518 | |
| Ether absolute | Traditional Chinese medicine | 80059618 | |
| Field Emission Transmission Electron Microscope | FEI Company | Tecnai G2 F 20 | |
| Gold(III) chloride trihydrate | Rhawn | R016035 | |
| Laser Particle-size Instrument | Malvern Instruments Ltd | ZetasizerNanoZS/Masterszer3000E | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride | Macklin | N808856 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Macklin | H6231 | |
| NMR software | Delta 5.2.1 | ||
| Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer | JEOL | JNM-ECZ600R/S3 | |
| Origin 8.5 | OriginLab | ||
| Penicillin | Sigma Aldrich | V900929-100ML | |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma Aldrich | 81188 | BioUltra, average Mn ~ 1000 |
| Poly (ethyleneimine) solution | Sigma Aldrich | 482595 | average Mn ~ 1200, 50 wt.% in H2O |
| Sodium borohydride, powder | Acros | C18930 | |
| Streptomycin | Sigma Aldrich | 85886-10ML | |
| Succinic anhydride | Traditional Chinese medicine | 30171826 | |
| Tetrahydrofuran | Traditional Chinese medicine | 40058161 | |
| Triethylamine | Traditional Chinese medicine | 80134318 | |
| UV/VIS/NIR Spectrometer | Lambda950 | Lambda950 | |
| X-ray Photoelectron Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | K-ALPHA 0.5EV |
References
- Abad, J. M., Bravo, I., Pariente, F., Lorenzo, E. Multi-tasking base ligand: a new concept of AuNPs synthesis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (9), 2329-2338 (2016).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Jang, B., Kwon, H., Katila, P., Lee, S. J., Lee, H. Dual delivery of biological therapeutics for multimodal and synergistic cancer therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 98, 113-133 (2016).
- Gansler, T., et al. Sixty years of CA: a cancer journal for clinicians. CA-A Cancer Journal for Clinicians. 60 (6), 345-350 (2010).
- Li, J., et al. Molecular Mechanism for Selective Cytotoxicity towards Cancer Cells of Diselenide-Containing Paclitaxel Nanoparticles. International Journal of Biological Sciences. 15 (8), 1755-1770 (2019).
- Zhao, D., et al. Precise ratiometric loading of PTX and DOX based on redox-sensitive mixed micelles for cancer therapy. Colloids Surfaces B: Biointerfaces. 155, 51-60 (2017).
- Blum, R. H., Carter, S. K. Adriamycin. A new anticancer drug with significant clinical activity. Annals of Internal Medicine. 80 (2), 249-259 (1974).
- de Lima, R. D. N., et al. Low-level laser therapy alleviates the deleterious effect of doxorubicin on rat adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Journal of Photochemistry Photobiology B. 196, 111512 (2019).
- Markowska, A., Kaysiewicz, J., Markowska, J., Huczynski, A. Doxycycline, salinomycin, monensin and ivermectin repositioned as cancer drugs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 29 (13), 1549-1554 (2019).
- Songbo, M., et al. Oxidative stress injury in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Toxicology Letters. 307, 41-48 (2019).
- Ewer, M. S., Ewer, S. M.
- Gabizon, A., Shmeeda, H., Barenholz, Y. Pharmacokinetics of pegylated liposomal Doxorubicin: review of animal and human studies. Clinical Pharmacokinetics. 42 (5), 419-436 (2003).
- Xu, X., Ho, W., Zhang, X., Bertrand, N., Farokhzad, O. Cancer nanomedicine: from targeted delivery to combination therapy. Trends in Molecular Medicine. 21 (4), 223-232 (2015).
- Feng, S., Nie, L., Zou, P., Suo, J. Effects of drug and polymer molecular weight on drug release from PLGA-mPEG microspheres. Journal of Applied Polymer Science. 132 (6), 41431 (2015).
- Chen, D., et al. Injectable Temperature-sensitive Hydrogel with VEGF Loaded Microspheres for Vascularization and Bone Regeneration of Femoral Head Necrosis. Materials Letters. 229, 138-141 (2018).
- Abadeer, N. S., Murphy, C. J. Recent Progress in Cancer Thermal Therapy Using Gold Nanoparticles. The Journal of Physical Chemistry C. 120 (9), 4691-4716 (2016).
- Riley, R. S., Day, E. S. Gold nanoparticle-mediated photothermal therapy: applications and opportunities for multimodal cancer treatment. WIREs Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (4), 1449 (2017).
- Fratoddi, I., et al. Highly Hydrophilic Gold Nanoparticles as Carrier for Anticancer Copper(I) Complexes: Loading and Release Studies for Biomedical Applications. Nanomaterials (Basel). 9 (5), 772 (2019).
- Lee, S. M., et al. Drug-loaded gold plasmonic nanoparticles for treatment of multidrug resistance in cancer. Biomaterials. 35 (7), 2272-2282 (2014).
- Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. The golden age: gold nanoparticles for biomedicine. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2740-2779 (2012).
- Wei, T., et al. Anticancer drug nanomicelles formed by self-assembling amphiphilic dendrimer to combat cancer drug resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (10), 2978-2983 (2015).
- Galluzzi, L., Buque, A., Kepp, O., Zitvogel, L., Kroemer, G. Immunological Effects of Conventional Chemotherapy and Targeted Anticancer Agents. Cancer Cell. 28 (6), 690-714 (2015).
- Muddineti, O. S., Ghosh, B., Biswas, S. Current trends in using polymer coated gold nanoparticles for cancer therapy. International Journal of Pharmaceutics. 484 (1-2), 252-267 (2015).
- Hu, W., et al. Methyl Orange removal by a novel PEI-AuNPs-hemin nanocomposite. Journal of Environmental Sciences. 53, 278-283 (2017).
- Gu, F. X., et al. Targeted nanoparticles for cancer therapy. Nano Today. 2 (3), 14-21 (2007).
- Srinivasarao, M., Galliford, C. V., Low, P. S. Principles in the design of ligand-targeted cancer therapeutics and imaging agents. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (3), 203-219 (2015).
- Liu, Z., Shi, Y., Chen, Z., Duan, L., Wang, X. Current progress towards the use of aptamers in targeted cancer therapy. Chinese Science Bulletin (Chinese Version). 59 (14), 1267 (2014).
- Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M.
- Vandghanooni, S., Eskandani, M., Barar, J., Omidi, Y. Antisense LNA-loaded nanoparticles of star-shaped glucose-core PCL-PEG copolymer for enhanced inhibition of oncomiR-214 and nucleolin-mediated therapy of cisplatin-resistant ovarian cancer cells. International Journal of Pharmaceutics. 573, 118729 (2020).
- Andghanooni, S., Eskandani, M., Barar, J., Omidi, Y. AS1411 aptamer-decorated cisplatin-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) nanoparticles for targeted therapy of miR-21-inhibited ovarian cancer cells. Nanomedicine. 13 (21), 2729-2758 (2018).
- Palmieri, D., et al. Human anti-nucleolin recombinant immunoagent for cancer therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9418-9423 (2015).
- Pichiorri, F., et al. In vivo NCL targeting affects breast cancer aggressiveness through miRNA regulation. Journal of Experimental Medicine. 210 (5), 951-968 (2013).
- Hou, S., McCauley, L. K., Ma, P. X. Synthesis and erosion properties of PEG-containing polyanhydrides. Macromolecular Bioscience. 7 (5), 620-628 (2007).
- Nie, L., et al. Injectable Vaginal Hydrogels as a Multi-Drug Carrier for Contraception. Applied Sciences. 9 (8), 1638 (2019).
- Zou, P., Suo, J., Nie, L., Feng, S. Temperature-responsive biodegradable star-shaped block copolymers for vaginal gels. Journal of Materials Chemistry. 22 (13), 6316-6326 (2012).
- Etrych, T., Šubr, V., Laga, R., Říhová, B., Ulbrich, K. Polymer conjugates of doxorubicin bound through an amide and hydrazone bond: Impact of the carrier structure onto synergistic action in the treatment of solid tumours. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 58, 1-12 (2014).
- Safari, F., Tamaddon, A. M., Zarghami, N., Abolmali, S., Akbarzadeh, A. Polyelectrolyte complexes of hTERT siRNA and polyethyleneimine: Effect of degree of PEG grafting on biological and cellular activity. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 44 (6), 1561-1568 (2016).
