Summary

تحريض من منتشر إصابة الدماغ أكسونال في الفئران على أساس تسارع التناوب

Published: May 09, 2020
doi:

Summary

هذا البروتوكول بالتحقق من صحة موثوق بها وسهلة الأداء واستنساخ نموذج القوارض من الدماغ منتشر إصابة المحور (DAI) الذي يسبب تلف المادة البيضاء على نطاق واسع دون كسور الجمجمة أو كدمات.

Abstract

إصابة الدماغ الرضية (TBI) هي السبب الرئيسي للوفاة والعجز. الإصابة المحورة المنتشرة (DAI) هي الآلية الغالبة للإصابة في نسبة كبيرة من مرضى TBI الذين يحتاجون إلى دخول المستشفى. DAI ينطوي على ضرر عصبي واسع النطاق من اهتزاز, دوران أو إصابة الانفجار, مما يؤدي إلى إصابة التمدد المحوري السريع والتغيرات المحورية الثانوية التي ترتبط مع تأثير طويل الأمد على الانتعاش الوظيفي. تاريخيا، النماذج التجريبية من DAI دون إصابة البؤري كان من الصعب تصميم. هنا نحن التحقق من صحة نموذج القوارض بسيطة وموثوق بها واستنساخ من DAI الذي يسبب تلف المادة البيضاء على نطاق واسع دون كسور الجمجمة أو كدمات.

Introduction

إصابة الدماغ الرضية (TBI) هي سبب رئيسي للوفاة والعجز في الولايات المتحدة. TBIs تساهم في حوالي 30٪ من جميع الوفيات المرتبطة بالإصابات1,2. تختلف الأسباب الرئيسية لـ TBI بين الفئات العمرية وتشمل السقوط والاصطدامات عالية السرعة أثناء الرياضة وإيذاء الذات المتعمد وحوادث السيارات والاعتداءات1و2و3.

إصابة محورية منتشر في الدماغ (DAI) هي نوع معين من TBI الناجمة عن تسارع الدوران أو الهز أو إصابة الانفجار في الدماغ الناتجة عن حركة الرأس غير المقيدة في لحظة بعد الإصابة4،5،6،7،8. DAI ينطوي على أضرار عصبية واسعة النطاق مما يؤدي إلى ضعف عصبي طويل الأمد يرتبط بالنتيجة السيئة ، وتكاليف الرعاية الصحية المرهقة ، ومعدل الوفيات 33-64٪1،2،4،,5،9،10،11. على الرغم من البحوث الهامة الأخيرة في الإمراض من DAI, لم يكن هناك توافق في الآراء حول أفضل خيارات العلاج11,,12,,13,,14.

على مدى العقود الماضية، حاولت العديد من النماذج التجريبية لتكرار بدقة جوانب مختلفة من DAI11،12،15،16. ومع ذلك، هذه النماذج لديها قيود نظرا للعرض الفريد من DAI بالمقارنة مع الإصابات البؤرية الأخرى. هذه النماذج السابقة ليس فقط تسبب إصابة محورية في مناطق المادة البيضاء ولكن أيضا يؤدي إلى إصابات الدماغ البؤري. سريريا، ويرافق DAI نزيف صغير، والتي قد تشكل سببا رئيسيا للضرر الذي يلحق بالمادة البيضاء.

وقد ثبت نموذجين فقط على الحيوانات لتكرار السمات السريرية الرئيسية لDAI. أنتجت Gennarelli وزملاؤه أول جهاز دوران الرأس الجانبي في عام 1982 ، وذلك باستخدام تسارع دوران الرأس غير الارتقان للحث على الغيبوبة مع DAI في نموذج الرئيسيات غير البشرية15. هذا النموذج الرئيسي اتّهم بالتناوب المتحكم به للتسارع والتباطؤ لإزاحة الرأس من خلال 60 درجة في غضون 10-20 مللي ثانية، وكانت هذه التقنية قادرة على محاكاة ضعف الوعي والضرر المحوري على نطاق واسع الذي يشبه آثار TBI الشديدة التي لوحظت في أدمغة الإنسان. ومع ذلك، نماذج4الرئيسيات مكلفة جدا11،,16. استنادا إلى نموذج سابق, نموذج خنزير من تسارع دوران إصابات الدماغ تم تصميمه في 1994 (روس وآخرون.) مع نتائج مماثلة14.

وقد أضاف هذان النموذجان الحيوانيان ، على الرغم من أنهما أنتجا عروضًا مختلفة من علم الأمراض النموذجي ، إلى حد كبير إلى مفاهيم التهاب الإمراض DAI. يتم قبول دوران الرأس السريع بشكل عام كأفضل طريقة لتحفيز DAI ، وتوفر القوارض نموذجًا أقل تكلفة لدراسات دوران الرأس السريع11،16. هنا، نحن التحقق من صحة نموذج القوارض بسيطة وموثوق بها واستنساخ من DAI الذي يسبب تلف المادة البيضاء على نطاق واسع دون كسور الجمجمة أو كدمات. هذا النموذج الحالي سوف تمكن من فهم أفضل للفيزيولوجيا المرضية من DAI وتطوير علاجات أكثر فعالية.

Protocol

وأجريت التجارب بناء على توصيات إعلاني هلسنكي وطوكيو وللمبادئ التوجيهية لاستخدام الحيوانات التجريبية للجماعة الأوروبية. وقد وافقت لجنة رعاية الحيوانات التابعة لجامعة بن غوريون في النقب على هذه التجارب. 1. إعداد الفئران للإجراء التجريبي ملاحظة: حدد الفئران ال…

Representative Results

ويوضح الجدول 1 الجدول الزمني للبروتوكول. وكان معدل الوفيات في هذا النموذج من DAI 0٪. وأشار اختبار مان ويتني إلى أن العجز العصبي كان أكبر بكثير بالنسبة للفئران 15 DAI مقارنة بالفئران الصورية الـ 15 في 48 ساعة بعد التدخل (Mdn = 1 مقابل 0)، U = 22.5، p & 0.001، r = 0.78 (انظر الجدول 2). يتم قياس البيا…

Discussion

يصف هذا البروتوكول نموذج القوارض من DAI. في DAI، يؤدي التسارع الدوراني على الدماغ إلى تأثير القص الذي يؤدي إلى تغييرات عصبية وكيميائية حيوية تؤدي إلى فقدان الوظيفة المحورية في عملية تدريجية. يتم إنتاج التغيرات المحورية الثانوية من قبل إصابة التمدد المحوري السريع وهي متغيرة في مداها وشدتها<su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ويعرب المؤلفان عن امتنانهما للدكتور ناثان كليورين (قسم الهندسة الميكانيكية، جامعة بن غوريون في النقب) على مساعدته في القياسات الميكانيكية الحيوية. كما نشكر البروفيسورة أولينا سيفيلنوفسكا، ومارينا كوشينيفا، وماكسيم كريفونوسوف، وداريا ياكومينيكو، وإيفجينيا غونتشاريك من قسم علم وظائف الأعضاء، كلية البيولوجيا، والبيئة، والطب، جامعة أوليس هونشار دنيبرو، دنيبرو، أوكرانيا على دعمها ومساهماتها المفيدة في مناقشاتنا.

Materials

0.01 M sodium citrate SIGMA – ALDRICH
2.5% normal horse serum SIGMA – ALDRICH H0146 Liquid
4 % buffered formaldehyde solution
Anti-Amyloid Precursor Protein, C – terminal antibodyproduced in rabbit SIGMA – ALDRICH Lot 056M4867V
biotinylated secondary antibody Vector BA-1000-1.5 10 mM sodium phosphate, pH 7.8, 0.15 M NaCl, 0.08% sodium azide, 3 mg/ml bovine serum albumin
bone-cutting forceps
DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit (with Nickel), 3,3’-diaminobenzidine vector laboratory
embedding cassettes
ethanol 99.9 % ROMICAL Flammable Liquid
guillotine
Hematoxylin SIGMA – ALDRICH H3136-25G
Hydrogen peroxide solution Millipore 88597-100ML-F
Isofluran, USP 100% Piramamal Critical Care, Inc
Olympus BX 40 microscope Olympus
paraffine paraplast plus leica biosystem Tissue embedding medium
phosphate-buffered saline (PBS) SIGMA – ALDRICH P5368-10PAK Contents of one pouch, when dissolved in one liter of distilled or deionized water, will yield 0.01 M phosphate buffered saline (NaCl 0.138 M; KCl – 0.0027 M); pH 7.4, at 25 °C.
Streptavidin HRP ABCAM ab64269 Streptavidin-HRP for use with biotinylated secondary antibodies during IHC / immunohistochemistry.
xylene

References

  1. Faul, M., Wald, M. M., Xu, L., Coronado, V. G. Traumatic brain injury in the United States; emergency department visits, hospitalizations, and deaths, 2002-2006. US Government. , (2010).
  2. Taylor, C. A., Bell, J. M., Breiding, M. J., Xu, L. Traumatic Brain Injury-Related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths – United States, 2007 and 2013. MMWR Surveillance Summaries. 66, 1-16 (2017).
  3. Peterson, A. B., Xu, L., Daugherty, J., Breiding, M. J. Surveillance report of traumatic brain injury-related emergency department visits, hospitalizations, and deaths, United States, 2014. US Government. , (2014).
  4. Su, E., Bell, M. Diffuse axonal injury. Translational Research in Traumatic Brain Injury. 57, 41 (2016).
  5. Hammoud, D. A., Wasserman, B. A. Diffuse axonal injuries: pathophysiology and imaging. Neuroimaging Clinics. 12, 205-216 (2002).
  6. Adams, J. H., Graham, D. I., Gennarelli, T. A., Maxwell, W. L. Diffuse axonal injury in non-missile head injury. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 54, 481-483 (1991).
  7. Slazinski, T., Johnson, M. C. Severe diffuse axonal injury in adults and children. Journal of Neuroscience Nursing. 26, 151-154 (1994).
  8. Gentleman, S. M., et al. Axonal injury: a universal consequence of fatal closed head injury. Acta Neuropathologica. 89, 537-543 (1995).
  9. Marehbian, J., Muehlschlegel, S., Edlow, B. L., Hinson, H. E., Hwang, D. Y. Medical Management of the Severe Traumatic Brain Injury Patient. Neurocritical Care. 27, 430-446 (2017).
  10. Adams, J. H., et al. Diffuse axonal injury in head injury: definition, diagnosis and grading. Histopathology. 15, 49-59 (1989).
  11. Xiao-Sheng, H., Sheng-Yu, Y., Xiang, Z., Zhou, F., Jian-ning, Z. Diffuse axonal injury due to lateral head rotation in a rat model. Journal of Neurosurgery. 93, 626-633 (2000).
  12. Ross, D. T., Meaney, D. F., Sabol, M. K., Smith, D. H., Gennarelli, T. A. Distribution of forebrain diffuse axonal injury following inertial closed head injury in miniature swine. Experimental Neurology. 126, 291-299 (1994).
  13. Bullock, R. Opportunities for neuroprotective drugs in clinical management of head injury. Journal of Emergency Medicine. 11, 23-30 (1993).
  14. Gennarelli, T. A. Mechanisms of brain injury. Journal of Emergency Medicine. 11, 5-11 (1993).
  15. Gennarelli, T. A., et al. Diffuse axonal injury and traumatic coma in the primate. Annals of Neurology. 12, 564-574 (1982).
  16. Xiaoshengi, H., Guitao, Y., Xiang, Z., Zhou, F. A morphological study of diffuse axonal injury in a rat model by lateral head rotation trauma. Acta Neurologica Belgica. 110, 49-56 (2010).
  17. Zlotnik, A., et al. beta2 adrenergic-mediated reduction of blood glutamate levels and improved neurological outcome after traumatic brain injury in rats. Journal of Neurosurgical Anesthesiology. 24, 30-38 (2012).
  18. Boyko, M., et al. An Alternative Model of Laser-Induced Stroke in the Motor Cortex of Rats. Biological Procedures Online. 21, 9 (2019).
  19. Boyko, M., et al. The neuro-behavioral profile in rats after subarachnoid hemorrhage. Brain Research. 1491, 109-116 (2013).
  20. Ma, J., Zhang, K., Wang, Z., Chen, G. Progress of Research on Diffuse Axonal Injury after Traumatic Brain Injury. Neural Plasticity. 2016, 9746313 (2016).
  21. Medana, I. M., Esiri, M. M. Axonal damage: a key predictor of outcome in human CNS diseases. Brain. 126, 515-530 (2003).
  22. Tang-Schomer, M. D., Johnson, V. E., Baas, P. W., Stewart, W., Smith, D. H. Partial interruption of axonal transport due to microtubule breakage accounts for the formation of periodic varicosities after traumatic axonal injury. Experimental Neurology. 233, 364-372 (2012).
  23. Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. Traumatic brain injury and amyloid-beta pathology: a link to Alzheimer’s disease. Nature Reviews Neuroscience. 11, 361-370 (2010).
  24. Sherriff, F. E., Bridges, L. R., Sivaloganathan, S. Early detection of axonal injury after human head trauma using immunocytochemistry for beta-amyloid precursor protein. Acta Neuropathologica. 87, 55-62 (1994).
  25. Reichard, R. R., White, C. L., Hladik, C. L., Dolinak, D. Beta-amyloid precursor protein staining of nonaccidental central nervous system injury in pediatric autopsies. Journal of Neurotrauma. 20, 347-355 (2003).
  26. Gentleman, S. M., Nash, M. J., Sweeting, C. J., Graham, D. I., Roberts, G. W. Beta-amyloid precursor protein (beta APP) as a marker for axonal injury after head injury. Neuroscience Letters. 160, 139-144 (1993).
  27. Smith, D. H., Hicks, R., Povlishock, J. T. Therapy development for diffuse axonal injury. Journal of Neurotrauma. 30, 307-323 (2013).
  28. McKenzie, K. J., et al. Is beta-APP a marker of axonal damage in short-surviving head injury. Acta Neuropathologica. 92, 608-613 (1996).
  29. Wilkinson, A., Bridges, L., Sivaloganathan, S. Correlation of survival time with size of axonal swellings in diffuse axonal injury. Acta Neuropathologicaogica. 98, 197-202 (1999).
  30. Thompson, H. J., et al. Lateral fluid percussion brain injury: a 15-year review and evaluation. Journal of Neurotrauma. 22, 42-75 (2005).
  31. Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. Lateral fluid percussion: model of traumatic brain injury in mice. Journal of Visualized Experiments. , e3063 (2011).
  32. Povlishock, J., Marmarou, A., McIntosh, T., Trojanowski, J., Moroi, J. Impact acceleration injury in the rat: evidence for focal axolemmal change and related neurofilament sidearm alteration. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 56, 347-359 (1997).
  33. Heath, D. L., Vink, R. Impact acceleration-induced severe diffuse axonal injury in rats: characterization of phosphate metabolism and neurologic outcome. Journal of Neurotrauma. 12, 1027-1034 (1995).
  34. Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: a new experimental brain injury model. Journal of Neurotrauma. 5, 1-15 (1988).
  35. Palmer, A. M., et al. Traumatic brain injury-induced excitotoxicity assessed in a controlled cortical impact model. Journal of Neurochemistry. 61, 2015-2024 (1993).
  36. Hamm, R. J., et al. Cognitive deficits following traumatic brain injury produced by controlled cortical impact. Journal of Neurotrauma. 9, 11-20 (1992).
  37. Nyanzu, M., et al. Improving on Laboratory Traumatic Brain Injury Models to Achieve Better Results. International Journal of Medical Sciences. 14, 494-505 (2017).
  38. Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nature Reviews Neuroscience. 14, 128-142 (2013).
  39. Lighthall, J. W., Dixon, C. E., Anderson, T. E. Experimental models of brain injury. Journal of Neurotrauma. 6, 83-97 (1989).
  40. Meaney, D. F., et al. Modification of the cortical impact model to produce axonal injury in the rat cerebral cortex. Journal of Neurotrauma. 11, 599-612 (1994).

Play Video

Cite This Article
Frank, D., Melamed, I., Gruenbaum, B. F., Grinshpun, J., Kuts, R., Shvartsur, R., Azab, A. N., Assadi, M. H., Vinokur, M., Boyko, M. Induction of Diffuse Axonal Brain Injury in Rats Based on Rotational Acceleration. J. Vis. Exp. (159), e61198, doi:10.3791/61198 (2020).

View Video