Индукция диффузной Аксональной травмы мозга у крыс на основе вращения ускорения

Summary

Этот протокол подтверждает надежную, легкую в исполнении и воспроизводимую модель грызунов, диффузную аксональную травму мозга (DAI), которая вызывает широкое повреждение белого вещества без переломов черепа или ушибов.

Abstract

Травматическая черепно-мозговая травма (ТБИ) является основной причиной смерти и инвалидности. Диффузная аксональная травма (DAI) является преобладающим механизмом травмы в большом проценте пациентов ТБИ, нуждающихся в госпитализации. DAI включает в себя широкое повреждение аксонального от встряхивания, вращения или взрыва травмы, что приводит к быстрой травмы аксонального растяжения и вторичные аксональные изменения, которые связаны с длительным воздействием на функциональное восстановление. Исторически экспериментальные модели DAI без координационных травм было трудно разработать. Здесь мы проверяем простую, воспроизводимую и надежную модель грызунов DAI, которая вызывает широкое повреждение белого вещества без переломов черепа или ушибов.

Introduction

Травматическая черепно-мозговая травма (TBI) является одной из основных причин смерти и инвалидности в Соединенных Штатах. TBIs способствовать около 30% всех травм, связанных смертей^1,2. Основные причины TBI различаются между возрастными группами и включают падения, скоростные столкновения во время занятий спортом, умышленное причинение себе вреда, дорожно-транспортных происшествий и нападений^1,2,3.

Мозг диффузной аксональной травмы (DAI) является специфическим типом TBI индуцированных вращательного ускорения, встряхивания или взрыва травмы головного мозга в результате неограниченного⁸движения головы в момент после травмы^4,5,6,7. DAI включает в себя широкое повреждение аксонального приводит к длительным неврологическим нарушениям, что связано с плохим результатом, обременительные расходы на здравоохранение, и 33-64% смертности^{1,2,4,99,,10,11}. Несмотря на значительные недавние исследования патогенеза DAI, не было консенсуса по лучшим вариантам лечения^11,12,13,14.

За последние десятилетия, многочисленные экспериментальные модели пытались точно воспроизвести различные аспекты DAI^11,12,15,16. Тем не менее, эти модели имеют ограничения, учитывая уникальную презентацию DAI по сравнению с другими фокусными травмами. Эти предыдущие модели не только вызывают аксональные повреждения в областях белого вещества, но и приводят к очаговым травмам головного мозга. Клинически, DAI сопровождается микро кровоизлияния, которые могут представлять собой основную причину повреждения белого вещества.

Только две модели животных были показаны, чтобы повторить ключевые клинические особенности DAI. Дженнарелли и его коллеги произвели первое боковое устройство вращения головы в 1982 году, используя неэффективное ускорение вращения головы, чтобы вызвать кому с DAI в нечеловеческой модели приматов¹⁵. Эта модель приматов использовала контролируемое однократное вращение для ускорения и замедления, чтобы вытеснить голову через 60 градусов в течение 10-20 мс. Эта техника была в состоянии подражать нарушенного сознания и широко ежексональных повреждений, которые напоминали последствия тяжелых TBI наблюдается в человеческом мозге. Тем не менее, примат модели очень дорогие^4,11,16. Основываясь частично на предыдущей модели, свинья модель вращения ускорения черепно-мозговой травмы была разработана в 1994 году (Росс и др.) с аналогичными результатами¹⁴.

Эти две модели животных, хотя они произвели различные презентации типичной патологии, значительно добавили к понятиям ПАтогенеза DAI. Быстрая вращение головы, как правило, принято как лучший метод для индуцирования DAI, и грызуны обеспечивают менее дорогую модель для быстрого исследования вращения головы^11,16. Здесь мы проверяем простую, воспроизводимую и надежную модель грызунов DAI, которая вызывает широкое повреждение белого вещества без переломов черепа или ушибов. Эта нынешняя модель позволит лучше понять патофизиологию ДАИ и развитие более эффективных методов лечения.

Protocol

Эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями Хельсинкских и Токиоских деклараций и Руководящими принципами по использованию экспериментальных животных Европейского сообщества. Эксперименты были одобрены Комитетом по уходу за животными Университета Бен-Гуриона в Негев…

Representative Results

Таблица 1 иллюстрирует временную шкалу протокола. Коэффициент смертности в этой модели ДАИ составил 0%. Тест Манн-Уитни показал, что неврологический дефицит был значительно больше для 15 ДАИ крыс по сравнению с 15 фиктивных крыс в 48 часов после вмешательства (Mdn No 1 против 0), U 22,5, р ю…

Discussion

Этот протокол описывает модель грызунов DAI. В DAI, вращательное ускорение на мозге вызывает эффект сдвига, который вызывает аксональные и биохимические изменения, которые приводят к потере аксональной функции в прогрессивном процессе. Вторичные аксональные изменения производятся быст?…

Materials

0.01 M sodium citrate	SIGMA – ALDRICH
2.5% normal horse serum	SIGMA – ALDRICH	H0146	Liquid
4 % buffered formaldehyde solution
Anti-Amyloid Precursor Protein, C – terminal antibodyproduced in rabbit	SIGMA – ALDRICH	Lot 056M4867V
biotinylated secondary antibody	Vector	BA-1000-1.5	10 mM sodium phosphate, pH 7.8, 0.15 M NaCl, 0.08% sodium azide, 3 mg/ml bovine serum albumin
bone-cutting forceps
DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit (with Nickel), 3,3’-diaminobenzidine	vector laboratory
embedding cassettes
ethanol 99.9 %	ROMICAL		Flammable Liquid
guillotine
Hematoxylin	SIGMA – ALDRICH	H3136-25G
Hydrogen peroxide solution	Millipore	88597-100ML-F
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc
Olympus BX 40 microscope	Olympus
paraffine	paraplast plus leica biosystem		Tissue embedding medium
phosphate-buffered saline (PBS)	SIGMA – ALDRICH	P5368-10PAK	Contents of one pouch, when dissolved in one liter of distilled or deionized water, will yield 0.01 M phosphate buffered saline (NaCl 0.138 M; KCl – 0.0027 M); pH 7.4, at 25 °C.
Streptavidin HRP	ABCAM	ab64269	Streptavidin-HRP for use with biotinylated secondary antibodies during IHC / immunohistochemistry.
xylene