Summary
פרוטוקול זה מספק הליך שלב אחר שלב לניתוח נטל טרשת עורקים בעכברים. חוקרים יכולים להשתמש בפרוטוקול זה כדי להשוות את השפע, המיקום והגודל של נגעים טרשת עורקים בבעלי חיים שונים.
Abstract
Apolipoprotein E (Apoe)- או קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (Ldlr)-עכברים היפרליפידמיים לקויים הם שני המודלים הנפוצים ביותר למחקר טרשת עורקים. הם משמשים כדי לחקור את ההשפעה של גורמים גנטיים שונים וסוגי תאים שונים על היווצרות נגע טרשת עורקים, כמו גם לבדוק את הפיתוח של טיפולים חדשים. בידוד, כריתה של אבי העורקים כולו, וכימות של שמן אדום O מוכתם נגעים טרשת עורקים הם שיטות מורפומטריות בסיסיות המשמשות להערכת נטל טרשת עורקים. מטרת פרוטוקול זה היא לתאר שיטה כירורגית ממוטבת, צעד אחר צעד כדי לנתח, perfuse-fix, לבודד, כתם, תמונה ולנתח נגעים טרשת עורקים באב העורקים של העכבר עם שמן אדום O. מכיוון שנגעים טרשת עורקים יכולים להיווצר בכל מקום בכל עץ אבי העורקים, כל שיטת הכתמת שמן אבי העורקים האדומה O יש את היתרון של הערכת לוחות עמוסי שומנים בדם באבי העורקים כולו וכל הענפים בעכבר אחד. בנוסף להכתמת שמן אדום O, אבי העורקים המלאים המבודדים הטריים יכולים לשמש למגוון של הפריה חוץ גופית וניסויים in vivo ובידודי תאים.
Introduction
מחלת לב כלילית, גורם מוביל לתמותה בארה"ב, נגרמת בדרך כלל על ידי טרשת עורקים, תהליך שמוביל להצטברות של פלאק בתוך קירות עורקים1. עכברים אפו- ו- Ldlr-נוטים להיפרליפידמיה הם מרכזיים בחקירות של טרשת עורקים וסיבוכיה ופיתוח הטיפולים2,3,4,5. כימות של נגעים טרשת עורקים מאבי העורקים en face הוא ניתוח נקודת קצה חשוב להערכת ההשפעה של מניפולציה גנטית בסוגי תאים שונים. זה גם עוזר ללמוד טיפולים חדשניים שנועדו להשפיע על ייזום מחלות טרשת עורקים, התקדמות ורגרסיה. נגעים טרשת עורקים יכולים להיווצר בכל מקום באבי העורקים ובענפיו (כלומר, עורקים ברכיוצפליים, עורקי הראש ותת-סלברי בחזה, כמו גם עורקי כליות, איליאק משותף ועצם הירך מתחת לסרעפת)6. הערכה מקיפה של נטל טרשת עורקים וטיפול מתאים דורשת הערכה של נטל המחלה במקומות שונים, אתגר שלעתים קרובות מתעלמים ממנו.
פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע ניתוח מקיף של נגעים טרשת עורקים, החל אבי העורקים שלם שלא נפתח וממשיך להכנה פנים, בעכבר אחד. כתמי שמן O אדום של שמן אבי העורקים שלא נפתחו מאפשר הערכה מהירה ואיכותית של לוחות עמוסי שומנים בדם בכל אבי העורקים וענפיו, בעוד הכנה לפנים מספקת הערכה כמותית של התפלגות נגע טרשת עורקים באבי העורקים של העכבר.
הטכניקה משתמשת בעכברים בני 8 שבועות עם מחיקת TGFβR2 ספציפית לתא שריר חלק על הרקע האפו-/היפרליפידמי (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/-; להלן מכונה עכברי TGFβR2iSMC-Apoe) ובקרות Apoe-/- המלטה (MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe-/-; להלן מכונה Apoe-/- עכברים). בעלי החיים נשמרים במשך 16 שבועות על דיאטה עתירת כולסטרול גבוהה שומן (HCHFD) כחומרי מחקר7. בסיום המחקר, אבי העורקים המלאים שלא נפתחו מוכתמים ומדומים (כולל כל הענפים העיקריים) עם שמן אדום O להערכה איכותית של לוחות עמוסי שומנים בדם. אבי העורקים נחתכים פתוחים באמצעות הכנה לפנים, וכל הנגעים הטרשת עורקים הם בתמונה ומכמתים. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ללמוד התפתחות נגע טרשת עורקים ב Apoe-/- או Ldlr-/- מודלים עכברים היפרליפידמיה ומורחב ליישומים כלליים הקשורים אבי העורקים ביולוגיה וסקולרית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
mT/mG (מלאי מס ' 007676), ו Apoe-/- (מניות מס '002052) עכברים נרכשו ממעבדת ג'קסון. עכברי Myh11-CreERT2 היו מתנה מסטפן פרובמנס (זמין ממעבדת ג'קסון כמלאי מספר 019079). עכברי Tgfbr2fl/fl התקבלו מהרולד ל. מוזס (אוניברסיטת ונדרבילט). כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו באמצעות פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת ייל.
1. עכברים
- לייצר MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe-/- ו MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/- עכברים כפי שתואר בעבר7. גזע זנים מוטנטיים לרקע C57BL / 6J במשך יותר מעשרה דורות.
הערה: קו העכבר Myh11-CreERT2 Cre מספק כלי רב עוצמה לחקר התפקיד של תאי שריר חלקים בהומיאוסטזיס וסקולרי ובפתולוגיה של כלי הדם. אלל Cre מוכנס לתוך כרומוזום Y; לפיכך, עכברות נקבות אינן מבטאות מבנה זה.
2. גנוטיפינג עכבר, אינדוקציה טמוקסיפן, והאכלה דיאטה עתירת כולסטרול עתירת שומן
- בצע genotyping עכבר באמצעות DNA אוזן העכבר וניתוח PCR. יש לבודד את ה- DNA של אוזן העכבר באמצעות ערכת בידוד ה- DNA של הדם והרקמות (טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן. פריימרים של PCR מפורטים בטבלה 1.
- לגרום רקומבינציה Cre-Lox על ידי הזרקת טמוקסיפן ב 1 מ"ג ליום i.p. במשך 5 ימים ב 6 שבועות MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe-/- ו MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/- עכברים זכרים.
- לגרום טרשת עורקים על ידי הצבת עכברים זכרים בני 8 שבועות (שבועיים לאחר טיפול טמוקסיפן) על דיאטה HCHF (40% שומן קק"ל, 1.25% כולסטרול, 0% חומצה כולית) במשך 16 שבועות.
3. ריאגנטים והכנת כלי ניתוח
- הכנת פתרון שמן אדום O: להמיס 1 גרם של שמן אדום O ב 100 מ"ל של אלכוהול איזופרופיל.
- הכנת פתרון שמן אדום O: לערבב 24 מ"ל של מלאי שמן אדום O פתרון עם 16 מ"ל של dH2O. לסנן את שמן אדום O מדולל עם מסנני מזרק סטרילי 0.45 מיקרומטר (הפתרון הוא טוב רק עבור 1-2 שעות).
- 60% הכנת אלכוהול איזופרופיל: לערבב 60 מ"ל של אלכוהול איזופרופיל עם 40 מ"ל של dH2O.
- 4% פורמלדהיד בהכנה DPBS 1x: לדלל 10 מ"ל של 16% פורמלדהיד ב 30 מ"ל של 1x DPBS.
- נקו את כל כלי הניתוח עם 70% אתנול (איור 1).
4. המתת חסד (איור 2א)
- מדוד את משקל העכבר לפני המתת חסד.
- המתת חסד לעכבר על ידי הזרקה תוך-פריטונית של קטמין וקסילזין (כל מיליליטר מכיל 10 מ"ג / מ"ל קטמין ו 2 מ"ג / מ"ל xylazine).
- מניחים את העכבר בתנוחה עלובה (צד הבטן עם הפנים כלפי מעלה).
5. פתיחת חלל החזה והבטן וזלוף הלב (איור 2B)
- הכן מזרק 10 מ"ל עם 10 מ"ל של 1x DPBS. כובע עם מחט 25 גרם. המזרק ישמש כדי לשטוף את הלב.
- החזק את העור עם פינצטה (סגנון 5) וחתוך עם מספריים עדינים מבסיס הבטן לחלק העליון של הצוואר.
- פתח את דופן הבטן מתחת לבית החזה.
- הרימו את עצם החזה עם פינצטה (סגנון 5) וחתכו את הסרעפת, ואז חתכו את בית החזה כדי לחשוף את חלל בית החזה.
- לעשות חתך קטן באטריום הימני של הלב.
- יש לעיין דרך ניקוב החדר השמאלי האפילי על ידי הזרקה איטית של 10 מ"ל של 1x DPBS. לאחר perfused ביסודיות, הכבד והכליות להיות חום בהיר בצבע.
- נקו את חלל החזה של דם ונוזלים זרים באמצעות ספוג לא ארוג כדי לספוג את החומר.
6. בידוד אבי העורקים והענפים (איור 2C)
- הסר איברים (כלומר, ריאות, כבד, טחול, ואיברי מערכת העיכול והרבייה) וחתוך את עצם הבריח באמצעות פינצטה (סגנון 5) ומספריים עדינים תוך השארת הלב, הכליות ואבי העורקים שלמים במקום.
הערה: הקפד לא לחתוך את הלב או כל כלי דם גדולים. - מקם את העכבר מתחת לסטריאומיקרוסקופ.
- נתח ענפי אבי העורקים ואבי העורקים כולל עורק ברכיוסקופלי, עורקי עורקים ראשיים, עורקים תת-בריחיים, עורקי כליות, עורקי איליאק נפוצים ועורקים הירך באמצעות פינצטה (סגנון 4) ומספריים קפיציות.
הערה: לכסות את אבי העורקים עם ספוג רטוב, לא ארוג, כדי למנוע התייבשות בעת ניתוח ענפי אבי העורקים. - לנתח ולהסיר בזהירות שומן הרפתקני ורקמת חיבור סביב ענפי אבי העורקים ואבי העורקים באמצעות פינצטה (סגנון 4) ומספריים קפיץ.
הערה: מאז דלקת בולטת בעכבר היפרליפידמיה מפרצת, קשה להסיר אדונטיציה. היזהרו לא לקרוע או לחתוך את ענפי אבי העורקים ואבי העורקים. צעד זה דורש תרגול וסבלנות.
7. תיקון הלב ואבי העורקים (איור 2D,ה)
- הכן מזרק 10 מ"ל עם 10 מ"ל של 4% פורמלדהיד ב 1x של DPBS. כובע עם מחט 25 גרם.
זהירות: פורמלדהיד מסוכן. קרא את ה- MSDS לפני שתעבוד עם הכימיקל הזה. יש ללבוש כפפות ומשקפי בטיחות ולייצר את פתרונות הדילול בתוך מכסה המנוע של האדים.
הערה: פתרון פורמלדהיד של 4% מתפרק עם הזמן. חשוב להשתמש 4% פורמלדהיד טרי עבור קיבעון. - לתקן את עץ כלי הדם באמצעות ניקוב חדר שמאלי apical על ידי הזרקה איטית 10 מ"ל של 4% פורמלדהיד.
הערה: קיבעון פורמלדהיד מפריע למספר יישומים במורד הזרם, כגון תרבית תאים, ניתוח FACS וניתוח ריצוף RNA חד-תאי. דלג על שלב זה אם אבי העורקים ישמש עבור כל אחד מיישומים אלה. - נקו את חלל החזה של כל נוזל חיצוני עם ספוג לא ארוג כדי לספוג את החומר.
- הפרד את הלב מאבי העורקים על ידי החזקת הלב עם פינצטה (סגנון 4) ושימוש במספריים קפיץ מיקרו-לנתח.
הערה: כדי לבצע en face שמן אדום O כתמים לאחר שלב זה, מומלץ לחתוך את אבי העורקים פתוח במקום ex vivo ולהמשיך לסעיף 8. זה מקל על אבי העורקים en face לשכב שטוח. - לבודד ולחתוך את אבי העורקים ואת הראשי שלה מ 1 מ"מ מעל העורק הראשי עד סוף עורק הירך באמצעות פינצטה (סגנון 4) ומספריים באביב.
- מעבירים את הכלי לצלחת פטרי שעווה או צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל וממלאים ב- DPBS 1x עד שהוא מכסה את אבי העורקים.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
8. כתמי שמן אדום O והדמיה של אבי העורקים שלם שלא נפתח (איור 3)
- הצמידו את הכלי לצלחת פטרי שעווה באמצעות סיכות מינוטין (איור 3A).
- לשטוף את הכלי פעם אחת עם 1x DPBS.
- יוצקים 25 מ"ל של תמיסת שמן אדום O טרייה לצלחת הפטרי (איור 3B).
הערה: (1) איזופרופנול מסוכן ונוזל דליק. השתמש בציוד מגן אישי מתאים. (2) פתרון שמן אדום O יכול בקלות לזרז. החלקיקים המואצים עלולים להפריע לכתמים הבאים. חשוב להסיר את המשקעים על ידי סינון פתרון שמן אדום O באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר לפני השימוש. (3) עדיף להכין פתרון שמן אדום O טרי להשליך כל פתרון שאינו בשימוש. (4) בנוסף שמן אדום O, סודאן הרביעי הוא תרכובת כימית נוספת המשמשת להכתמת שומנים, טריגליצרידים, ליפופרוטאינים. עם זאת, שמן אדום O החליף בהדרגה סודאן הרביעית כי הצבע האדום המיוצר על ידי שמן אדום O הוא אינטנסיבי יותר ובכך יכול לעשות שומן הרבה יותר קל לראות. - מכתימים את אבי העורקים במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר (RT). שמן אדום O יהיה להכתים פלאק עשיר בשומנים אדום, משאיר אחרים שאינם פלאק המכיל אזורים חיוורים בצבע.
- לשטוף פעם אחת במשך 20 דקות עם 60% איזופרופנול ב RT.
הערה: שטיפה יתר יכולה לבטל את הטיית הלוח. - לשטוף את אבי העורקים 3x עם dH2O במשך 5 דקות כדי להסיר איזופרופנול.
- תחת סטריאומיקרוסקופ, נקו בעדינות את כל רקמת השומן הפרי-וסקולרית סביב אבי העורקים באמצעות פינצטה (סגנון 4) ומספריים קפיציות (איור 3C,D).
הערה: חשוב לנקות את כל רקמת השומן הפרי-וסקולרית סביב אבי העורקים וענפיו לאחר הכתמה, מכיוון שרקמת שומן פרי וסקולרית מוכתמת בשמן אדום O יכולה להניב רקע כוזב ולהפריע למורפומטריה פלאק וכימות אזור פלאק. הקפידו לא להסיר חלק מקיר אבי העורקים. ממלאים את צלחת השעווה ב- dH2O עד שהיא מכסה את אבי העורקים המוכתם במהלך הניקוי. צעד זה דורש תרגול וסבלנות. - מעבירים את הכלי למגלשת מיקרוסקופ זכוכית נקייה.
- השג מיקרוגרפים דיגיטליים באמצעות מצלמה המחוברת למיקרוסקופ אור. שמור תמונות ברזולוציה גבוהה, רצוי בתבנית קובץ תמונה מתויגת (TIFF) (איור 3E).
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. כדי למנוע את אב העורקים להתייבש, להעביר את הכלי לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל ולמלא עם 1x DPBS עד שהוא מכסה את אבי העורקים. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 °C (65 °F).
9. הרכבה של אבי העורקים (איור 4, איור 5)
- מעבירים את כלי הדם לצלחת פטרי שעווה וממלאים ב- DPBS 1x עד שהוא מכסה את אבי העורקים.
- חתוך את עורקי הראש, העורקים התת-בריחיים של קשת אבי העורקים ועורקי איליאק באבי העורקים בבטן 1-2 מ"מ לאחר bifurcations. תנתק את עורקי הכליות. (איור 4A)
- חיתוך אורך של הכנת אבי העורקים לאורך העקמומיות הפנימית (איור 4B1) ועורקי איליאק לבדם (איור 4B2) עם מספריים קפיציים זעירים.
- חותכים את שלושת הענפים של קשת אבי העורקים (כלומר, innominate, עורק ראשי משותף שמאל, עורק תת-בריחי שמאל) לאורך העקמומיות הגדולה יותר עד לרמת הבסיס של העקמומיות הפנימית (סימן x) (איור 4B3–B8) עם מספריים קפיץ מיקרו-ניתוח.
- הצמידו את אבי העורקים השטוח (לומן בצד עם הפנים כלפי מעלה) בצלחת שעווה עם סיכות מינוטין והחלו 1x DPBS עד שהוא מכסה את אבי העורקים כדי למנוע ממנו להתייבש (איור 4C).
הערה: (1) חשוב להפוך את אבי העורקים המגולגל שטוח ולהצמיד אותו לפנים מבלי למתוח. צעד זה ייקח כמה ימים בהתאם לחומרת טרשת עורקים. (2) עבור אבי העורקים מ Apoe-/- או Ldlr-/- בעלי חיים, מומלץ להצמיד את אבי העורקים שטוח במשך 24 שעות. (3) הפרוטוקול ניתן להשהות כאן. - נקו את מגלשות המיקרוסקופ מזכוכית עם 70% אתנול ומגבי משימות עדינים (איור 5A).
- העבירו את אבי העורקים למגלשת מיקרוסקופ זכוכית נקייה והניחו 15 טיפות של טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) על מגלשת מיקרוסקופ זכוכית נקייה נוספת (איור 5B).
- הניחו בזהירות את שקופית מיקרוסקופ הזכוכית עם תרכובת OCT מעל אבי העורקים והימנעו מלתפוס בועות אוויר בשקופית (איור 5C).
- תייג/י את השקופיות בשמות לדוגמה (איור 5D).
הערה: ניתן לאחסן את מגלשות אבי העורקים המותקנות בתא הלחות בטמפרטורה של 4 °C (65 °F) למשך מספר חודשים.
10. כימות הדמיה ונגע של אבי העורקים en face (איור 6)
- השג מיקרוגרפים דיגיטליים באמצעות מצלמה המחוברת למיקרוסקופ אור. שמור תמונות ברזולוציה גבוהה, רצוי בתבנית קובץ תמונה מתויגת (TIFF) (איור 6A).
- העבר תמונות של אבי העורקים המוכתם בפנים למחשב המצויד בתוכנת ImageJ.
- ב- ImageJ, בחר בכלי "בחירה חופשית" וסובב את כל הלוח המוכתם בשמן אדום O באופן ידני (כתמים אדומים עזים) בעת הקשה על מקש "Alt" (עבור Windows PC) או על מקש "Shift" (עבור Mac). לאחר מכן, לחצו על "מדידה" בתפריט "נתח" כדי להציג אזורי נגע בחלון התוצאה (איור 6B משמאל).
הערה: ישנן מספר מלכודות של כימות של נגעים טרשת עורקים: (1) כל חתיכות קטנות של שומן הרפתקני מוכתם שנותר מחובר לאבי העורקים משלב 8.7 יכול להניב רקע כוזב ולהפריע לכימות פלאק; (2) הסרת חלק מקיר אבי העורקים או פגיעה באבי העורקים משלבים 6.4 ו-8.7 עלולים להפריע לכימות הפלאק; (3) בועות וקפלים שנוצרו באבי העורקים לאחר ההרכבה (שלב 9.8) יכולים להפריע לכימות פלאק; ו-(4) פלאק טרשת עורקים הוא תופעה תלת-ממדית, ומדידות המבוצעות במישור דו-ממדי עשויות שלא לשקף את ההיקף האמיתי של הלוח. בנוסף לניתוח של אזור פלאק אבי העורקים en face, מומלץ לנתח את גודל הפלאק בשורש אבי העורקים, בעורק brachiocephalic, אבי העורקים העולה ואבי העורקים בבטן בנפרד8. - הקיפו את קו הגבול החיצוני של אבי העורקים ולחצו על "מדידה" בתפריט "נתח" כדי להציג את אזור אבי העורקים בחלון התוצאה (איור 6B מימין).
- יצא את כל המידות לקובץ Excel.
- חשב את היחס בין שטח הפלאק מאזור אבי העורקים הכולל ונורמל את הערך כאחוז משטח השטח הכולל של שמן אדום O.
- חשב את היחס של שטח פלאק ב 8-10 Apoe-/- ו 8-10 TGFβR2iSMC-Apoe עכברים. הצג את הנתונים כממוצע ± SEM (איור 6C).
- בצע בדיקת t של סטודנט שלא תוקן לניתוח סטטיסטי של היחס בין נתוני אזור פלאק בהשוואה לקבוצת עכברים אחרת. שקול את ההבדלים בערכים ממוצעים כמשמעותיים ב- p < 0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בפרוטוקול זה, נגעים טרשת עורקים בעכברים TGFβR2iSMC-Apoe נותחו לאחר 4 חודשים בדיאטת HCHF7. בנוסף לטרשת עורקים נרחבת, עכברים אלה פיתחו מפרצות אבי העורקים בבית החזה ובבטן, כפי שדווח בעבר. בהשוואה לעכברים אפו-/- עכברים, קירות אבי העורקים של עכברי TGFβR2iSMC-Apoe הראו טרשת עורקים חמורה, מה שמקשה על ניתוח הנגעים (איור 2C,D,E). בנוסף, המפרצות נרחבות במיוחד מתחת לאבי העורקים העל-טבעי, המזכירות מאוד מפרצות אבי העורקים האנושיות המתקדמות.
תמונה מכתימה של שמן אבי העורקים האדום O של אבי העורקים שלא נפתחה מעכבר TGFβR2iSMC-Apoe שהוזן על ידי HCHFD מוצגת באיור 3E. התמונה מציגה עכבר TGFβR2iSMC-Apoe שפיתח מפרצת אבי העורקים העולה והבטן, והוא מראה היווצרות נגע טרשת עורקים מואצת בענפי אבי העורקים (כאן, עורק הברכיוסקופלי, עורק הראש, עורקים תת-סלבריים, עורקי איליאק, עורקי הירך ועורקי הכליות).
איור 6A מציג את תמונת הכתם של עכברי Apoe-// ו-TGFβR2iSMC-Apoe. בהשוואה לקבוצה Apoe-/-, TGFβR2iSMC-Apoe עכברים הציגו הגדלה מפרצת חמורה התארכות ניכרת של אבי העורקים כולו.
איור 1: כלי ניתוח המשמשים בפרוטוקול. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: פרוטוקול שלב אחר שלב להוצאת אבי העורקים מהעכבר בדיאטת HCHF.
זה מ 24 שבועות TGFβR2iSMC-אפו עכבר מוזן במשך 4 חודשים על כולסטרול גבוה שומן גבוה (HCHF) דיאטה. (A) עכבר תחת הרדמה קטמין / קסילן. קווים מקווקווים מציינים היכן לחתוך את העור. (B) ניתוח של העכבר כדי לחשוף את חללי בית החזה והבטן. (ג) הסרה זהירה של האיברים הפנימיים (כלומר, ריאות, כבד, טחול, ואיברי מערכת העיכול ורבייה) ואחריו חשיפה של אבי העורקים של העכבר תחת מיקרוסקופ ניתוח. (ד) הסרה זהירה של רקמות החיבור לאורך אבי העורקים בצורה נקייה ככל האפשר. (ה) תמונה של אבי העורקים כולו המבודד עם ענפים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: פרוטוקול שלב אחר שלב להכתמה והדמיה של שמן אבי העורקים שלא נפתח.
(א) הצמדת כל אבי העורקים עם ענפים על צלחת פטרי שעווה. (B) כיסוי אבי העורקים בתמיסת מכתמת שמן אדום O. (ג) איור של אבי העורקים כולו לאחר כתמי שמן אדום O. (D) איור של שמן אדום O מוכתם אבי העורקים שלם לאחר ניקוי. (E) פוטומיקוגרפיות מייצגות של שמן אדום O מוכתם אבי העורקים שלם של TGFβR2iSMC-Apoe עכברים לאחר 4 חודשים על דיאטה HCHF. (א') תמונת הגדלה גבוהה של אבי העורקים העולה מ-(א) ו-(ב') תמונת הגדלה גבוהה של אבי העורקים בבטן מ- (b). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: פרוטוקול שלב אחר שלב להכנת אבי העורקים.
(א,ב) עץ העורקים המוכתם בשמן אדום O נפתח לאורך כדי לשטח את אבי העורקים להדמיה. קווים מנוקדים לאורך קיר כלי השיט ומספרים מצביעים על חתכים רציפים שנועדו לפתוח את כלי השיט. (C) אורך מפוצל והצמיד אבי העורקים שלם על צלחת פטרי שעווה בצורת Y. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: פרוטוקול שלב אחר שלב להרכבת אבי העורקים.
(א) ניקוי עדין של מגלשות מיקרוסקופ הזכוכית עם 70% אתנול וייבוש עם מגבוני מעבדה נקיים. (B) יישום של תרכובת OCT על פני השטח של שקופית מיקרוסקופ זכוכית אחת, ולאחר מכן התפשטות של אבי העורקים en face שטוח על שקופית מיקרוסקופ זכוכית האחרת. (ג) מיקום עדין של שקופית מיקרוסקופ הזכוכית עם תרכובת OCT על גבי מדגם אבי העורקים en face. (ד) הוספת תיוג לשקופית בשם לדוגמה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: פרוטוקול שלב אחר שלב להדמיית אב העורקים en face וכימות נגע טרשת עורקים.
(A) מיקרופוטוגרפים של אבי העורקים en face מ Apoe-/- ו TGFβR2iSMC-Apoe עכברים לאחר 4 חודשים על דיאטה HCHF מוכתם שמן אדום O. (B) תמונות הממחישות את התהליך לכימות בסיוע מחשב של נגעים טרשת עורקים. (C) כימות אזור נגע: אזור נגע % מתייחס שמן אדום O מוכתם כאחוז של פני השטח אבי העורקים הכולל. כל הנתונים המוצגים כממוצע ± SEM (***p < 0.001; מבחן t של סטודנט דו-זנבי לא מזווג; n = 9 עבור עכברי Apoe-// - ו- n = 9 עבור עכברי TGFβR2iSMC-Apoe). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| MYH11-CreERT2 | 5'-TGA CCC חתול CTC TTC ACT CC-3' | |
| 5'-AAC TCC ACG ACC ACC TCA TC-3' | ||
| 5'-AGT CCC TCA חתול CCT CAG GTT-3' | ||
| Tgfbr2fl/fl | 5'-TAA ACA AGG TCC GGA GCC CA-3' | |
| 5'-ACT TCT GCA AGA GGT CCC CT-3' | ||
| אפואה | 5'-GCC תג CCG AGG GAG AGC CG-3' | |
| 5'-TGT GAC TTG GGA GCT CTG CAG C-3' | ||
| 5'-GCC GCC CCG ACT GCA TCT-3' | ||
טבלה 1: פריימרים של גנוטיפינג.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Apolipoprotein E (Apoe) ו צפיפות נמוכה ליפופרוטאין קולטן (Ldlr) עכברים לקויים שימושיים לחקר פיתוח וטיפול של טרשת עורקים. חוקרים יכולים להעריך את ההשפעה של גנטיקה ומניפולציות טיפוליות על ייזום מחלות הקשורות לטרשת עורקים, התקדמות ורגרסיה באמצעות מכתם שמן אדום O של אבי העורקים כולו. שמן אבי העורקים אדום O כתמים וכימות נגע הוא נקודת הקצה הסטנדרטית זהב למחקר טרשת עורקים. טכניקה זו היא זולה ואינה דורשת ציוד מיוחד10. עם זאת, זה לא קל להשיג באיכות גבוהה שמן אדום O מוכתם רקמה. בהתבסס על ניסיון קודם, ישנם שלושה שלבים קריטיים בפרוטוקול זה, וכל ההליך דורש תרגול וסבלנות. הצעד הקריטי הראשון הוא היכולת לנתח, להסיר ולנקות את כל רקמת השומן הפרי-וסקולרית סביב אבי העורקים וענפיו לפני ואחרי כתמי שמן אדום O (איור 2D, איור 3C,D). השלב המרכזי השני הוא הכנת פתרון שמן אדום O טרי ומסונן. לבסוף, חשוב שאבי העורקים יהיה שטוח על צלחת שעווה לפני שהם עולים על מגלשות המיקרוסקופ מזכוכית (איור 4C, איור 5B, C).
בהשוואה לפרוטוקולים אחרים של מכתים שמן אדום O, שיטה זו מספקת הערכות איכותיות וכמותיות של לוחות עמוסי שומנים בדם באבי העורקים שלא נפתחו ואבי העורקים en face מעכבר יחיד. ההערכה האיכותית הראשונית של כתמי שמן אדום O שלא נפתחו מספקת מושג כללי על התפלגות הפלאק וגודל הפלאק באבי העורקים, כמו גם את כל הענפים לפני כימות אבי העורקים. מגבלות המחקר הן כי (1) השוואה וניתוח דו-ממדיים של לוחות טרשת עורקים תלת-ממדיים אינם משקפים את ההיקף האמיתי של נפחי פלאק טרשת עורקים, (2) כימות נגע טרשת עורקים הוא זמן רב, ו -(3) זה דורש הקרבת בעלי חיים.
לאחר אבי העורקים מבודד בהצלחה, זה יכול לשמש למגוון רחב של בדיקות למחקרים מולקולריים. לדוגמה, זה יכול לשמש למחקרים ביומכניים וניתוח היסטולוגי כדי לאפיין מורפולוגיה אבי העורקים רג'ינל11. בנוסף, משתמשים יכולים לבודד תאי אנדותל ותאי שריר חלקים מאבי העורקים שלם המבודדים טריים עבור תרבית תאים, ניתוח FACS וניתוח ריצוף RNA חד-תאי. לסיכום, פרוטוקול זה מספק הליך שלב אחר שלב לניתוח נטל טרשת עורקים בעכברים. חוקרים יכולים להשתמש בפרוטוקול זה כדי להשוות שפע נגע טרשת עורקים, מיקום וגודל בין בעלי חיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה, בין השאר, על ידי קונסורציום ביולוגיה משותף Microgrant שסופק תחת מענק NIH P30AR070253 (P.-Y.C.), ו HL135582 (MS. ). אנו מודים לר' וובר ול.ל. קון על תחזוקת העכברים המשמשים במחקר זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tube | DENVILLE | C2170 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 16% Formaldehyde | Polysciences | 18814-10 | |
| 70% ethanol | VWR | RC2546.70-5 | To clean the dissection tools |
| Black dissection wax | CR Scientific | C3541 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | Solvent for Tamoxifen |
| DNeasy Blood & Tissue kit | QIAGEN | 69506 | To isolate DNA from mouse ear |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4 | Gibco | 14190-144 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | |
| High cholesterol high fat diet | Research Diets | D12108 | To induce atherosclerosis |
| Imaging software | National Institutes of Health | Image J | Aortic lesion quantification |
| Isopropanol | VWR | JT9079-5 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | To clean the glass microscope slides |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | ROBOZ | RS-5602 | To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches |
| Microscope control software | Olympus | DP Controller | For aorta imaging |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Needle-25G | BD | 305124 | |
| NonWoven Sponge | McKesson | 94442000 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | To stain the atherosclerosis lesions |
| Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane | VWR | 28143-312 | To filter working Oil Red O solution |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15021-15 | To dissect and clean the aorta |
| Statistical software | GraphPad | Prism 8 | Statical analysis |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | For aorta dissection |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | For aorta imaging |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | To induce Cre-loxP recombination |
| Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek | VWR | 25608-930 | |
| Tweezer Style 4 | Electron Microscopy Sciences | 0302-4-PO | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Tweezer Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 0302-5-PO | To dissect and clean the aorta |
References
- Lusis, A. J.
- Emini Veseli, B., et al.
- Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71, 343-353 (1992).
- Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258, 468-471 (1992).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. Journal of Clinical Investigation. 92, 883-893 (1993).
- Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arteriosclerosis Thrombosis. 14, 133-140 (1994).
- Chen, P. Y., et al. Smooth muscle cell reprogramming in aortic aneurysms. Cell Stem Cell. 26, 542-557 (2020).
- Andres-Manzano, M. J., Andres, V., Dorado, B. Oil Red O and Hematoxylin and Eosin Staining for Quantification of Atherosclerosis Burden in Mouse Aorta and Aortic Root. Methods in Molecular Biology. 1339, 85-99 (2015).
- Chen, P. Y., et al. Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis. Nature Metabolism. 1, 912-926 (2019).
- Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8, 1149-1154 (2013).
- Ferruzzi, J., Madziva, D., Caulk, A. W., Tellides, G., Humphrey, J. D. Compromised mechanical homeostasis in arterial aging and associated cardiovascular consequences. Biomechanics and Modeling Mechanobiology. 17, 1281-1295 (2018).
