Monitoring Cancer Cell Invasion en T-Cell Cytotoxicity in 3D Cultuur
Summary
De gepresenteerde aanpak evalueert tegelijkertijd kankercelinvasie in 3D-sferoïde testen en T-celcytotoxiciteit. Sferoïden worden gegenereerd in een steiger-vrije agarose multi-microwell gegoten. Co-cultuur en inbedding in type I collageen matrix worden uitgevoerd in hetzelfde apparaat dat het mogelijk maakt om kankercel invasie en T-cel gemedited cytotoxiciteit te controleren.
Abstract
Er is aanzienlijke vooruitgang geboekt bij de behandeling van kanker met immunotherapie, hoewel een groot aantal kankers resistent blijft tegen behandeling. Een beperkt aantal tests zorgen voor directe monitoring en mechanistische inzichten in de interacties tussen tumor- en immuuncellen, waaronder T-cellen een belangrijke rol spelen bij het uitvoeren van de cytotoxische reactie van het adaptieve immuunsysteem op kankercellen. De meeste tests zijn gebaseerd op tweedimensionale (2D) co-cultuur van cellen als gevolg van het relatieve gebruiksgemak, maar met beperkte vertegenwoordiging van de invasieve groei fenotype, een van de kenmerken van kankercellen. Huidige driedimensionale (3D) co-cultuur systemen vereisen ofwel speciale apparatuur of aparte monitoring voor invasie van co-gekweekte kankercellen en interactie T-cellen.
Hier beschrijven we een aanpak om tegelijkertijd het invasieve gedrag in 3D van kankercelsferoïden en T-celcytotoxiciteit in co-cultuur te monitoren. Sferoïde vorming wordt aangedreven door verbeterde celcelinteracties in steigervrije agarose microwell-afgietselt met U-vormige bodems. Zowel T-cel co-cultuur en kanker cel invasie in type I collageen matrix worden uitgevoerd binnen de microwells van de agarose werpt zonder de noodzaak om de cellen over te dragen, waardoor een intacte 3D co-cultuur systeem in de hele test. De collageenmatrix kan worden gescheiden van de agarose gegoten, waardoor immunofluorescentie (IF) kleuring en voor confocale beeldvorming van cellen. Ook kunnen cellen worden geïsoleerd voor verdere groei of worden onderworpen aan analyses zoals voor genexpressie of fluorescentie geactiveerde celsordening (FACS). Ten slotte kan de 3D co-cultuur worden geanalyseerd door immunohistochemie (IHC) na inbedding en sectie. Mogelijke wijzigingen van de test omvatten veranderde samenstellingen van de extracellulaire matrix (ECM) en de opname van verschillende stromale of immuuncellen met de kankercellen.
Introduction
Ondanks aanzienlijke verbeteringen in kanker immunotherapie in het afgelopen decennium, onze mechanistische begrip van gevoeligheid en weerstand tegen behandelingen zijn nog steeds vrij slecht1. Het is algemeen vastgesteld dat tumoren een aanzienlijke heterogeniteit vertonen, en dat de dynamische interacties van de tumorcellen met hun micro-omgeving en met de immuuncellen, impact tumorceldood, invasief gedrag en reactie op behandelingen die immunotherapieomvatten 1,2,3. Als een arm van het adaptieve immuunsysteem, T-cellen uit te voeren cel-specifieke cytotoxiciteit. De analyse van T-celherkenning en respons op kankercellen biedt mechanistische inzichten in resistentie en gevoeligheid voor immuunmodulatorische behandelingen.
In vitro modellering en monitoring interacties tussen kanker en T-cellen in een geschikte omgeving is uitdagend en tot nu toe resulteerde in beperkte mechanistische inzichten. De meeste celgebaseerde tests zijn gebaseerd op een tweedimensionale (2D) omgeving, dat ontbreekt aan belangrijke kenmerken die van cruciaal belang zijn voor het samenvatten van de driedimensionale (3D) in vivo fysiologie4,5,6, namelijk ruimtelijke celcelinteracties, contact met de extracellulaire matrix (ECM)7, dynamische metabole vraag, verhoogde hypoxie als gevolg van massagroei8, en effecten van de tumormicro-omgeving (TME)9. Aan de andere kant zijn er nog een aantal tekortkomingen met de momenteel gebruikte driedimensionale (3D) co-cultuur en invasie testsystemen: (1) de tijdrovende aard van sferoïde generatie en oogst5,10, (2) het gebrek aan controle over de sferoïde grootte, vorm en celdichtheid11,12, (3) de test van het lage doorvoertype, (4) de eis voor speciale apparatuur13,14, (5) de noodzaak om de cocultuur voor verschillende testen 15 ,16,16,17in verschillende omgevingen over te brengen . Met name de overdracht van een co-cultuurtest leidt vaak tot verstoring van sferoïden en verlies van de integriteit van de co-cultuur. Dit geldt vooral voor “losse” sferoïden met verminderde cel-celhechting. De meeste 3D-invasietesten vereisen bijvoorbeeld dat sferoïden na hun eerste formatie worden geoogst en vervolgens opnieuw worden opgetrokken in ECM14,15,16. Deze resuspensiestap resulteert in een verlies van controle over de afstand tussen sferoïden. Aangezien de afstand tussen tumorsferoïden hun invasief gedrag beïnvloedt, introduceert dit verlies van controle hoge inter-assay variantie en vermindert de reproduceerbaarheid. Bovendien is de toepassing van celfrasectiontesten door opeenvolgende centrifugatiestappen voor de beoordeling van de perifere en tumorsferoïde infiltrerende immuuncellen beperkt tot tumorcelpopulaties die stabielere sferoïden genereren17.
Concept en aanpak
Onze aanpak richt zich op de bovengenoemde tekortkomingen met behulp van een “All-in-One”-3D sferoïde co-cultuur model, die niet vereist dat de overdracht van sferoïden voor latere tests. We hebben een sferoïde vormingsapparaat (zie Tabel van Materialen)aangepast om een test te genereren voor gelijktijdig monitorend invasief gedrag van kankercellen en cytotoxiciteit van co-gekweekte T-cellen. Deze methode is gebruiksvriendelijk, goedkoop en zorgt voor een snelle en eenvoudige bediening in een relatief hoge doorvoer 3D-instelling. Afhankelijk van het gebruikte type apparaat kunnen tot 81 grote sferoïden van uniforme grootte worden gegenereerd in één pipettingstap met controle over de individuele sferoïde grootte door het aantal ingezaaide cellen te wijzigen. Sferoïde vorming wordt gedwongen door verbeterde celcelinteracties in steigervrije agarose multi-well afgietsten met U-vormige bodems. We hebben dit 3D-systeem aangepast voor dynamische celgebaseerde functionele studies en endpoint moleculaire en biochemische tests die fluorescentie geactiveerde celsorden (FACS), immunofluorescentie (IF) of immunohistochemie (IHC) kleuring omvatten, evenals genexpressieanalyse van de intacte 3D co-cultuur.
Voor functionele studies, inbedden sferoïden in type I collageen binnen de agarose werpt resulteert in invasie van kankercellen van equidistant sferoïden en maakt het mogelijk monitoring van essentiële cellijn-specifieke kenmerken, zoals eencellige vs collectieve cel migratie18,19. Bovendien is de collageenmatrix gemakkelijk gescheiden van de agarose-cast, wat resulteert in een 1\u20122 mm dikke patch met meerdere sferoïden, die verder kan worden verwerkt voor IF-vlekken en beeldvorming door confocale microscopie. Dit kan onthullen verschillende celinvasie en cel-matrix interacties in een high-throughput screening. Ook kunnen cellen in de collageenmatrix worden geïsoleerd na de vertering van collageen en eencellige dissociatie voor latere celkweek of -analyse.
Voor IHC-analyse van sferoïdenzijn na fixatie en sectie van de agarose gegoten eiwitten of andere moleculen van belang detecteerbaar met behoud van de geografische posities van de sferoïden. In de hier beschreven aanpak, sferoïden zijn direct ingebed in Hydroxyethyl agarose processing gel binnen de agarose gegoten en de gel dient als een “deksel” om de sferoïden te behouden aan de onderkant van de microwells. Na paraffine inbedding van de agarose gegoten20, seriële horizontale sectie wordt uitgevoerd met de onderkant van de cast die als uitgangspunt.
Deze aanpak contrasteert met conventionele IHC-sectie van sferoïden die het oogsten van cellen vereist voordat ze inhydroenen worden genomen in Hydroxyethyl agarose processing gel21 en riskeert verstoring van sferoïden waardoor de ruimtelijke ordening van cellen verloren gaat. Ook celfractionering door centrifugatie voor het beoordelen of immuuncellen geïnfiltreerd of perifeer bleven tot tumorsferoïden17 wordt vermeden door directe inbedding.
Bovendien, 3D co-cultuur kan worden uitgevoerd door het mengen van tumor, stromale of immuuncellen, en dus het bestuderen van tumorcel crosstalk of het opnieuw vatten van verschillende tumor micro-omgevingen voor het analyseren van cel-cel interacties met inbegrip van co-culturen met endotheelcellen16.
Deze 3D sferoïde co-cultuur instelling kan worden gebruikt om co-cultuur van verschillende celtypes aanwezig in de tumor micro-omgeving uit te voeren en om de effecten van veranderde ECM-elementen te beoordelen. Naast type I collageen kunnen andere ECM-componenten (bijvoorbeeld matrigel, matrigel/collageenmengsels, fibronectine) worden gebruikt omdat tumorcelinvasie wordt beïnvloed door de overvloed aan verschillende substraten22. Ook zijn de microwells van de agarose gegoten geschikt voor sferoïde vorming van primaire cellijnen en voor cellen met een lage celcelhechting.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier gepresenteerde methode beschrijft 3D tumor sferoïde generatie, die co-cultuur met T-cellen, cel-gebaseerde functionele en moleculaire testen, evenals een verscheidenheid aan monitoring en analyse mogelijkheden met behulp van een enkel apparaat. Het grote voordeel van onze aanpak is dat het niet vereist overdracht van de 3D-cultuur naar een aparte test en handhaaft de integriteit van de 3D-cultuur in de hele test.
De hier gepresenteerde workflow kan naar behoefte worden gewijzigd. De i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Virginie Ory, PhD voor nuttige discussies en advies over de aanpak van de 3D co-cultuur model. We danken Elizabeth Jones ook voor uitstekende technische bijstand bij de IHC-sectie. Deze studie werd ondersteund door subsidies van de DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) aan YL (LI 2547/4-1) en de National Institutes of Health to AW (R01 CA231291), naar ATR (R01 CA205632), naar GWP (R01 CA218670) en de Core Grant van het Cancer Center (P30 CA51008).
Materials
| 3D Petri Dishes | Microtissues Inc | Z764019 & Z764051 | referred to as "rubber molds" in the protocols; 81-microwell & 35-microwell molds |
| 8-well Chamber Slides | Lab-Tek | 154534 | |
| Agarose Type I, low EEO | Sigma-Aldrich | A6013 | |
| anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody | Agilent | K4003 | ready to use |
| Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg | Millipore | 08-115 | |
| Collagenase Type 4, 1 g | Worthington | LS004188 | |
| DMEM, fetal bovine serum | ThermoFisher | 11965092, 16000044 | referred to as "cell culture medium" in the protocols |
| Harris hematoxylin | ThermoFisher | SH30-500D | |
| HistoGel | ThermoFisher | HG-4000-012 | referred to as "Hydroxyethyl agarose processing gel" in the protocols |
| Hoechst | Life Technologies | H1399 | 1/1000 dilution |
| Phalloidin 546 | Invitrogen | 486624 | 1/200 dilution |
| rabbit anti-CD8 antibody | Cell Signaling | 98941 | 1/25 dilution |
| rat anti-keratin 8 | DSHB | TROMA-I AB_531826 | 1/500 dilution |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | referred to as "RNA extraction kit" in the protocols |
| RPMI | ThermoFisher | 11875093 | for T-cell culture medium |
| Triton X-100 | BioRad | 1610407 | referred to as "Octoxynol" in the protocols |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | referred to as "guanidinium thiocyanate with phenol" in the protocols |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | referred to as "polysorbate 20" in the protocols |
| TypLE | ThermoFisher | 12604013 | referred to as "cell dissociation enzymes solution" in the protocols |
References
- Chen, D. S., Mellman, I. Elements of cancer immunity and the cancer-immune set point. Nature. 541 (7637), 321-330 (2017).
- Sharma, P., Allison, J. P. Dissecting the mechanisms of immune checkpoint therapy. Nature Reviews Immunology. 20 (2), 75-76 (2020).
- Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities. Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116 (12), 2377-2388 (2003).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
- xu, x., Farach-Carson, M. C., Jia, x. Three-dimensional In vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).
- Lamichhane, S. P., et al. Recapitulating epithelial tumor microenvironment In vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells. BioMed Central Cancer. 16 (581), (2016).
- Klimkiewicz, K., et al. A 3D model of tumour angiogenic microenvironment to monitor hypoxia effects on cell interactions and cancer stem cell selection. Cancer Letters. 396, 10-20 (2017).
- Cavo, M., et al. Microenvironment complexity and matrix stiffness regulate breast cancer cell activity in a 3D In vitro model. Scientific Reports. 6, 35367 (2016).
- Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. K., Simeonov, A. High throughput fluoresecent imaging approaches for drug discovery using In vitro and in vivo three-dimensional models. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (12), 1347-1361 (2015).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for In vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 11 (6), 19103 (2016).
- Veelken, C., Bakker, G., Drell, D., Friedl, P. Single cell-based automated quantification of therapy responses of invasive cancer spheroids in organotypic 3D culture. Methods. 1 (128), 139-149 (2017).
- Puls, T. J., et al. Development of a Novel 3D Tumor-tissue Invasion Model for High-throughput, High-content Phenotypic Drug Screening. Scientific Reports. 8 (1), 13039 (2018).
- Jenkins, R. W., et al. Ex Vivo Profiling of PD-1 Blockade Using Organotypic Tumor Spheroids. Cancer Discovery. 8 (2), 196-215 (2018).
- Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. Journal of Visualized Experiments. 20 (105), (2015).
- Shoval, H., et al. Tumor cells and their crosstalk with endothelial cells in 3D spheroids. Scientific Reports. 7 (1), 10428 (2017).
- Giannattasio, A., et al. Cytotoxicity and infiltration of human NK cells in in vivo-like tumor spheroids. BioMed Central Cancer. 3 (15), 351 (2015).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- McLennan, R., et al. Neural crest migration is driven by a few trailblazer cells with a unique molecular signature narrowly confined to the invasive front. Development. 142 (11), 2014-2025 (2015).
- Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks. Journal of Visualized Experiments. (99), e52868 (2015).
- Brenner, W., et al. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Letters. 155 (2), 199-205 (2000).
- Farhat, Y. RNA Extraction from Collagen Gels Using Qiagen’s RNeasy Kit. The Protocol Place. 2012, (2019).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).
