Monitoramento da invasão celular cancerígena e citotoxicidade de células T na cultura 3D
Summary
A abordagem apresentada avalia simultaneamente a invasão de células cancerígenas em ensaios esferoides 3D e citotoxicidade de células T. Esferoides são gerados em um elenco multi-microwell livre de andaimes. A cocultura e a incorporação na matriz de colágeno tipo I são realizadas dentro do mesmo dispositivo que permite monitorar a invasão de células cancerígenas e a citotoxicidade mediada por células T.
Abstract
Avanços significativos foram feitos no tratamento do câncer com imunoterapia, embora um grande número de cânceres permaneça resistente ao tratamento. Um número limitado de ensaios permite o monitoramento direto e insights mecanicistas sobre as interações entre tumor e células imunes, entre as quais, as células T desempenham um papel significativo na execução da resposta citotóxica do sistema imunológico adaptativo às células cancerosas. A maioria dos ensaios são baseados na co-cultura bidimensional (2D) das células devido à relativa facilidade de uso, mas com representação limitada do fenótipo de crescimento invasivo, uma das marcas das células cancerosas. Os sistemas de cocultura tridimensionais atuais (3D) exigem equipamentos especiais ou monitoramento separado para invasão de células cancerígenas co-cultivadas e células T interativas.
Aqui descrevemos uma abordagem para monitorar simultaneamente o comportamento invasivo em 3D de esferoides de células cancerosas e citotoxicidade de células T na co-cultura. A formação esferoide é impulsionada por interações células-células aprimoradas em moldes de microwell agarose livres de andaimes com fundos em forma de U. Tanto a co-cultura das células T quanto a invasão de células cancerígenas na matriz de colágeno tipo I são realizadas dentro das microwells dos moldes de agarose sem a necessidade de transferir as células, mantendo assim um sistema de cocultura 3D intacto durante todo o ensaio. A matriz de colágeno pode ser separada do molde de agarose, permitindo a coloração da imunofluorescência (IF) e para imagens confocal das células. Além disso, as células podem ser isoladas para maior crescimento ou submetidas a análises como para expressão genética ou fluorescência ativada de classificação celular (FACS). Finalmente, a cocultura 3D pode ser analisada pela imunohistoquímica (IHC) após a incorporação e secção. As possíveis modificações do ensaio incluem composições alteradas da matriz extracelular (ECM), bem como a inclusão de diferentes células estromais ou imunes com as células cancerosas.
Introduction
Apesar de melhorias significativas na imunoterapia contra o câncer na última década, nossa compreensão mecanicista da sensibilidade e resistência aos tratamentos ainda é bastante pobre1. Está bem estabelecido que os tumores apresentam heterogeneidade substancial, e que as interações dinâmicas das células tumorais com seu microambiente, bem como com as células imunes, impactam a morte celular tumoral, comportamento invasivo e resposta a tratamentos que incluem imunoterapia1,,2,3. Como um braço do sistema imunológico adaptativo, as células T executam citotoxicidade específica das células. A análise do reconhecimento de células T e a resposta às células cancerosas fornecem insights mecanicistas sobre resistência e sensibilidade aos tratamentos modulatórios imunológicos.
A modelagem in vitro e o monitoramento das interações entre câncer e células T em um ambiente apropriado tem sido desafiador e, até agora, resultou em insights mecanicistas limitados. A maioria dos ensaios baseados em células dependem de um ambiente bidimensional (2D), que carece de características-chave que são fundamentais para recapitular a fisiologia tridimensional (3D) in vivo4,5,6, ou seja, interações células espaciais, contato com a matriz extracelular (ECM)7, demanda metabólica dinâmica, aumento da hipóxia devido ao crescimento de massa8, e efeitos do microambiente tumoral (TME)9. Por outro lado, ainda há uma série de deficiências com os sistemas de cocultura tridimensional (3D) atualmente utilizados (3D): (1) a natureza demorada da geração e colheita esferoides5,,10, (2) a falta de controle sobre o tamanho do esferoide, forma e densidade celular11,12, (3) ensaios do tipo de baixo rendimento, (4) a exigência de equipamento especial13,,14, (5) a necessidade de transferir a cocultura para ambientes distintos para diferentes ensaios15,,16,,17. Em particular, a transferência de um ensaio de co-cultura muitas vezes leva à interrupção dos esferoides e à perda da integridade da co-cultura. Isso se aplica especialmente a esferoides “soltos” com menor adesão celular. Por exemplo, a maioria dos ensaios de invasão 3D exigem que os esferoides sejam colhidos após sua formação inicial e, em seguida, resuspendidos em ECM14,15,16. Esta etapa de resuspensão resulta em uma perda de controle sobre a distância entre os esferoides. Uma vez que a distância entre os esferoides tumorais impacta seu comportamento invasivo, essa perda de controle introduz alta variância entre ensaios e reduz a reprodutibilidade. Além disso, a aplicação de ensaios de fracionamento celular por etapas de centrifugação consecutivas para avaliação das células imunes periféricas e tumorais infiltradas é limitada a populações de células tumorais que geram esferoides mais estáveis17.
Conceito e abordagem
Nossa abordagem aborda as deficiências acima mencionadas usando um modelo de cocultura spheroid 3D “All-in-One” — que não requer a transferência de esferoides para ensaios subsequentes. Adaptamos um dispositivo de formação de esferoides (ver Tabela de Materiais) para gerar um ensaio para monitorar simultaneamente o comportamento invasivo das células cancerosas e a citotoxicidade das células T co-cultivadas. Este método é fácil de usar, barato e permite um manuseio rápido e fácil em uma configuração 3D relativamente de alto rendimento. Dependendo do tipo de dispositivo utilizado, até 81 esferoides de grande porte uniforme podem ser gerados em uma única etapa de pipetação com controle sobre o tamanho esferoide individual modificando o número de células semeadas. A formação esferoide é forçada por interações células-células aprimoradas em elencos multi-poços livres de andaimes com fundos em forma de U. Adaptamos este sistema 3D para estudos funcionais baseados em células dinâmicas, bem como ensaios moleculares e bioquímicos que incluem fluorescência ativada de classificação celular (FACS), imunofluorescência (IF) ou imunohistoquímica (IHC), bem como análise de expressão genética da cocultura 3D intacta.
Para estudos funcionais,a incorporação de esferoides no colágeno tipo I dentro das castas agarose resulta na invasão de células cancerígenas de equidistantes e permite monitorar características essenciais da linha celular, como migração celular única vs. células coletivas18,,19. Além disso, a matriz de colágeno é facilmente separada do molde de agarose, resultando em um patch de 1\u20122 mm de espessura contendo vários esferoides, que podem ser processados para coloração de IF e imagens por microscopia confocal. Isso pode revelar distintas interações de invasão celular e matriz celular em uma triagem de alto rendimento. Além disso, as células da matriz de colágeno podem ser isoladas após a digestão do colágeno e dissociação de células únicas para posterior cultivo ou análise celular.
Para a análise de IHC de esferoides,após fixação e secção do molde de agarose, proteínas ou outras moléculas de interesse são detectáveis mantendo as posições geográficas dos esferoides. Na abordagem descrita aqui, os esferoides estão diretamente incorporados no gel de processamento de hidroxietila agarose dentro do molde de agarose e o gel serve como uma “tampa” para reter os esferoides na parte inferior dos microwells. Após a incorporação da parafina do elenco20,a seção horizontal serial é realizada com a parte inferior do elenco servindo como ponto de partida.
Essa abordagem contrasta com a secção convencional de Spheroids que requer a colheita de células antes de incorporar em gel de processamento de hidroxietilaagarose 21 e corre o risco de interrupção de esferoides, perdendo assim o arranjo espacial das células. Além disso, o fracionamento celular por centrifugação para avaliar se as células imunes infiltraram ou permaneceram periféricas aos esferoides tumorais17 é evitada pela incorporação direta.
Além disso, a cocultura 3D pode ser realizada por tumores admixantes, células estrômicas ou imunes, e, assim, estudar o crosstalk de células tumorais ou recapitular diferentes microambientes tumorais para analisar interações células-células, incluindo co-culturas com células endoteliais16.
Esta configuração de cocultura esféide 3D pode ser usada para realizar a co-cultura de diferentes tipos de células presentes no microambiente tumoral e para avaliar os efeitos dos elementos ECM alterados. Além do colágeno tipo I, outros componentes do ECM (por exemplo, matrigel, misturas de matrigel/colágeno, fibronectina), podem ser usados uma vez que a invasão de células tumorais é impactada pela abundância de diferentes substratos22. Além disso, as microiádeas do elenco de agarose são adequadas para a formação esferoide de linhas celulares primárias e para células com baixa adesão celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método aqui apresentado descreve a geração de esferoides tumorais 3D, que permite a co-cultura com células T, ensaios funcionais e moleculares baseados em células, bem como uma variedade de possibilidades de monitoramento e análise usando um único dispositivo. A grande vantagem da nossa abordagem é que ela não requer a transferência da cultura 3D para um ensaio separado e mantém a integridade da cultura 3D ao longo dos ensaios.
O fluxo de trabalho aqui apresentado pode ser modific…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Virginie Ory, PhD por discussões úteis e conselhos sobre a abordagem do modelo de cocultura 3D. Agradecemos também a Elizabeth Jones pela excelente assistência técnica com a secção IHC. Este estudo foi apoiado por subvenções do DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) para YL (LI 2547/4-1) e dos Institutos Nacionais de Saúde para AW (R01 CA231291), para ATR (R01 CA205632), para GWP (R01 CA218670) e a Bolsa Núcleo do Centro de Câncer (P30 CA51008).
Materials
| 3D Petri Dishes | Microtissues Inc | Z764019 & Z764051 | referred to as "rubber molds" in the protocols; 81-microwell & 35-microwell molds |
| 8-well Chamber Slides | Lab-Tek | 154534 | |
| Agarose Type I, low EEO | Sigma-Aldrich | A6013 | |
| anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody | Agilent | K4003 | ready to use |
| Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg | Millipore | 08-115 | |
| Collagenase Type 4, 1 g | Worthington | LS004188 | |
| DMEM, fetal bovine serum | ThermoFisher | 11965092, 16000044 | referred to as "cell culture medium" in the protocols |
| Harris hematoxylin | ThermoFisher | SH30-500D | |
| HistoGel | ThermoFisher | HG-4000-012 | referred to as "Hydroxyethyl agarose processing gel" in the protocols |
| Hoechst | Life Technologies | H1399 | 1/1000 dilution |
| Phalloidin 546 | Invitrogen | 486624 | 1/200 dilution |
| rabbit anti-CD8 antibody | Cell Signaling | 98941 | 1/25 dilution |
| rat anti-keratin 8 | DSHB | TROMA-I AB_531826 | 1/500 dilution |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | referred to as "RNA extraction kit" in the protocols |
| RPMI | ThermoFisher | 11875093 | for T-cell culture medium |
| Triton X-100 | BioRad | 1610407 | referred to as "Octoxynol" in the protocols |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | referred to as "guanidinium thiocyanate with phenol" in the protocols |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | referred to as "polysorbate 20" in the protocols |
| TypLE | ThermoFisher | 12604013 | referred to as "cell dissociation enzymes solution" in the protocols |
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