3D培養におけるがん細胞浸潤とT細胞毒性のモニタリング
Summary
提示されたアプローチは、3DスフェロイドアッセイおよびT細胞細胞毒性における癌細胞浸潤を同時に評価する。スフェロイドは、足場のないアガロースマルチマイクロウェルキャストで生成されます。I型コラーゲンマトリックスにおける共培養および埋め込みは、同じ装置内で行われ、癌細胞浸潤およびT細胞媒介性細胞傷害をモニタリングすることができる。
Abstract
多くの癌は治療に耐性を持ち続けているが、免疫療法による癌の治療には大きな進歩が見られた。アッセイの限られた数は、腫瘍と免疫細胞の相互作用に直接監視し、機械化的な洞察を可能にし、その中で、T細胞は、癌細胞に対する適応免疫系の細胞傷害応答を実行する上で重要な役割を果たす。ほとんどのアッセイは、使用の相対的な容易さによる細胞の2次元(2D)共培養に基づいていますが、癌細胞の特徴の1つである侵襲的な成長表現型の表現は限られています。現在の3次元(3D)共培養システムは、特別な装置または共培養癌細胞の侵入と相互作用T細胞のための別々の監視を必要とします。
ここでは、共培養における癌細胞スフェロイドとT細胞細胞毒性の3Dにおける侵襲的挙動を同時にモニタリングするアプローチについて述べている。スフェロイド形成は、U字型の底部を有する足場を含まないアガロースマイクロウェルキャストにおける細胞間相互作用の強化によって駆動される。T細胞共培養および癌細胞の両方のI型コラーゲンマトリックスへの浸潤は、アガロースキャストのマイクロウェル内で細胞を転移することなく行われ、アッセイ全体で無傷の3D共培養システムを維持する。コラーゲンマトリックスはアガロースキャストから分離することができ、免疫蛍光(IF)染色および細胞の共焦点イメージングを可能にする。また、細胞は、さらなる増殖のために単離したり、遺伝子発現や蛍光活性化細胞選別(FACS)などの分析を行ったりすることができる。最後に、3D共培養は、埋め込みおよび切除後の免疫検査(IHC)によって分析することができる。アッセイの可能な修飾は、細胞外マトリックス(ECM)の変質された組成物だけでなく、癌細胞と異なる間質または免疫細胞を含めることが含まれる。
Introduction
過去10年間のがん免疫療法の大幅な改善にもかかわらず、治療に対する感受性と耐性に関する私たちの機械学的理解はまだかなり貧弱です。腫瘍が実質的な不均一性を示し、腫瘍細胞とそれらの微小環境および免疫細胞との動的相互作用が、腫瘍細胞死に影響を与え、免疫療法11、2、32,3を含む治療に対する侵襲的な行動および応答を示すことが十分に確立されている。適応免疫系の一つの腕として、T細胞は細胞特異的細胞毒性を実行する。T細胞認識とがん細胞への応答の分析は、免疫調節治療に対する耐性と感受性に関する機械的な洞察を提供します。
適切な環境におけるがんとT細胞の相互作用をインビトロでモデル化し、モニタリングすることは困難であり、これまでのところ、限られた機械主義的な洞察をもたらしました。ほとんどの細胞ベースのアッセイは、生体,内生理学44、5、6、すなわち空間細胞相互作用、細胞外マトリックス(ECM)7との接触、5動的代謝需要、質量増殖による低酸素増加8、および微小微生物(TME)の微小環境(9ME)の影響による増大する3次元(3D)を再現するために重要な重要な特徴を欠く2次元(2D)環境に依存している。679一方、現在使用されている3次元(3D)共培養と侵略アッセイシステムには、まだ多くの欠点があります:(1)スフェロイド生成と,収穫5、10、(2)10スフェロイド5サイズの制御の欠如の時間を消費する性質、 形状および細胞密度11、12、(3)12低スループット型アッセイは、(4)特殊機器13、14、(5)異なるアッセイ111415、16、17,16に対する異なる環境に共培養を移す必要性を要求する。,17特に、共培養アッセイの転移は、しばしばスフェロイドの破壊および共培養完全性の喪失をもたらす。これは、細胞-細胞接着が減少した「緩い」スフェロイドに特に当てはまります。例えば、ほとんどの3Dの侵略アッセイは、スフェロイドが最初の形成後に収穫され、ECM 14、15、1615,16で再中断されることを要求する。14このリサスペンションステップは、回転楕円体間の距離に対する制御の損失をもたらす。腫瘍スフェロイド間の距離は侵襲的な挙動に影響を与えるので、この制御の喪失は高いアッセイ間分散を導入し、再現性を低下させる。さらに、末梢および腫瘍スフェロイド浸潤免疫細胞の評価のための連続した遠心分離工程による細胞分画アッセイの適用は、より安定したスフェロイド17を生成する腫瘍細胞集団に限定される。
コンセプトとアプローチ
当社のアプローチでは、上記の不具合に対して、後述のアッセイ用に回転楕円体の移動を必要としない「オールインワン」3Dスフェロイド共培養モデルを使用して対処しています。我々は、スフェロイド形成装置( 材料表を参照)を適応させ、同時に癌細胞の侵襲的挙動と共培養T細胞の細胞傷害性をモニタリングするためのアッセイを生成した。この方法はユーザーフレンドリーで安価で、比較的高スループットの3D設定で迅速かつ容易に処理できます。使用される装置のタイプに依存して、最大81の大きい均一サイズのスフェロイドは、播種された細胞の数を変更することによって個々のスフェロイドサイズを制御して単一のピペットステップで生成することができる。スフェロイド形成は、U字型の底部を有する足場を含まないアガロースマルチウェルキャストにおける細胞間相互作用の強化によって強制される。この3Dシステムは、動的細胞ベースの機能研究と、蛍光活性化細胞選別(FACS)、免疫蛍光(IF)または免疫組織化学(IHC)染色、無傷の3D共培養の遺伝子発現解析を含むエンドポイント分子および生化学的アッセイに適応させた。
機能研究のために、アガロースキャスト内のI型コラーゲンにスフェロイドを埋め込むと、等距離のスフェロイドからの癌細胞の浸潤を生じ、単一細胞対集団細胞移動18、19,19などの必須細胞株特異的特徴をモニタリングすることを可能にする。さらに、コラーゲンマトリックスはアガロースキャストから容易に分離され、複数のスフェロイドを含む1\u20122 mmの厚さのパッチをもたらし、共焦点顕微鏡によるIF染色およびイメージングのためにさらに処理することができる。これにより、ハイスループットスクリーニングで細胞浸潤と細胞マトリックス相互作用が明確に明らかになります。また、コラーゲンマトリックス中の細胞は、コラーゲン消化後に単一細胞解離後に分離して、その後の細胞培養または分析を行うことができる。
スフェロイドのIHC分析では、アガロースキャストの固定および切除後、タンパク質または関心のある他の分子が、スフェロイドの地理的位置を維持しながら検出可能である。ここで説明するアプローチでは、スフェロイドはアガロースキャスト内のHydroxyethylアガロース処理ゲルに直接埋め込まれ、ゲルはマイクロウェルの底部にスフェロイドを保持する「蓋」として機能する。アガロースキャスト20のパラフィン埋め込み後、連続横切りは、キャストの底部を出発点として行う。
このアプローチは、Hydroxyethylアガロース処理ゲル21 に埋め込む前に細胞の収穫を必要とするスフェロイドの従来のIHC断面とは対照的であり、このように細胞の空間配置を失うスフェロイドの破壊を招くリスクがある。また、腫瘍スフェロイド17 に浸潤した免疫細胞または末梢のいずれに免疫細胞が直接埋め込まれるのかを評価するための遠心分離による細胞分画は、直接埋め込むことによって回避される。
さらに、3D共培養は、腫瘍、間質または免疫細胞を付着させることによって行うことができる、そしてこのように腫瘍細胞クロストークを研究するか、または内皮細胞16との共培養を含む細胞間相互作用を分析するための異なる腫瘍微小環境を再現する。
この3Dスフェロイド共培養設定は、腫瘍微小環境に存在する異なる細胞タイプの共培養を行い、改変されたECM要素の効果を評価するために使用することができる。I型コラーゲン以外にも、他のECM成分(例えば、マトリゲル、マトリゲル/コラーゲン混合物、フィブロネクチン)は、腫瘍細胞浸潤が異なる基質22の存在によって影響を受けるので使用することができる。また、アガロースキャストのマイクロウェルは、一次細胞株のスフェロイド形成および低細胞接着を有する細胞に適している。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで提示される方法は、T細胞との共培養、細胞ベースの機能的および分子アッセイ、ならびに単一の装置を用いた様々なモニタリングおよび分析の可能性を可能にする3D腫瘍スフェロイド生成について説明する。我々のアプローチの大きな利点は、3D培養物を別のアッセイに移す必要がなくて、アッセイ全体で3D培養の完全性を維持する点です。
ここで示すワークフロ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
3Dコカルチャーモデルのアプローチに関する有益な議論やアドバイスをしてくれたヴァージニー・オリ博士に感謝します。また、エリザベス・ジョーンズのIHC断面に関する優れた技術支援に感謝します。この研究は、DFG(ドイツ・フォルシュングスゲミンシャフト)からYL(LI 2547/4-1)および国立衛生研究所からAW(R01 CA231291)、ATR(R01 CA205632)、GWP(R01 CA218670)への助成金とCA00がんセンターのコアグラント(Ca00がんセンター)への助成金によって支えられた。
Materials
| 3D Petri Dishes | Microtissues Inc | Z764019 & Z764051 | referred to as "rubber molds" in the protocols; 81-microwell & 35-microwell molds |
| 8-well Chamber Slides | Lab-Tek | 154534 | |
| Agarose Type I, low EEO | Sigma-Aldrich | A6013 | |
| anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody | Agilent | K4003 | ready to use |
| Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg | Millipore | 08-115 | |
| Collagenase Type 4, 1 g | Worthington | LS004188 | |
| DMEM, fetal bovine serum | ThermoFisher | 11965092, 16000044 | referred to as "cell culture medium" in the protocols |
| Harris hematoxylin | ThermoFisher | SH30-500D | |
| HistoGel | ThermoFisher | HG-4000-012 | referred to as "Hydroxyethyl agarose processing gel" in the protocols |
| Hoechst | Life Technologies | H1399 | 1/1000 dilution |
| Phalloidin 546 | Invitrogen | 486624 | 1/200 dilution |
| rabbit anti-CD8 antibody | Cell Signaling | 98941 | 1/25 dilution |
| rat anti-keratin 8 | DSHB | TROMA-I AB_531826 | 1/500 dilution |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | referred to as "RNA extraction kit" in the protocols |
| RPMI | ThermoFisher | 11875093 | for T-cell culture medium |
| Triton X-100 | BioRad | 1610407 | referred to as "Octoxynol" in the protocols |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | referred to as "guanidinium thiocyanate with phenol" in the protocols |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | referred to as "polysorbate 20" in the protocols |
| TypLE | ThermoFisher | 12604013 | referred to as "cell dissociation enzymes solution" in the protocols |
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