Überwachung der Krebszellinvasion und T-Zell-Zytotoxizität in der 3D-Kultur
Summary
Der vorgestellte Ansatz bewertet gleichzeitig die Krebszellinvasion in 3D-Sphäroid-Assays und t-Zell-Zytotoxizität. Sphäroide werden in einem gerüstfreien Agarose-Multi-Mikrowell-Guss erzeugt. Co-Kultur und Einbettung in Typ I Kollagenmatrix werden innerhalb des gleichen Geräts durchgeführt, das Krebszellinvasion und T-Zell vermittelte Zytotoxizität zu überwachen ermöglicht.
Abstract
Bei der Behandlung von Krebs mit Immuntherapie wurden erhebliche Fortschritte erzielt, obwohl eine große Anzahl von Krebsarten weiterhin resistent gegen die Behandlung ist. Eine begrenzte Anzahl von Assays ermöglicht eine direkte Überwachung und mechanistische Einblicke in die Wechselwirkungen zwischen Tumor- und Immunzellen, unter denen T-Zellen eine wichtige Rolle bei der Durchführung der zytotoxischen Reaktion des adaptiven Immunsystems auf Krebszellen spielen. Die meisten Assays basieren auf einer zweidimensionalen (2D) Kokultur von Zellen aufgrund der relativen Benutzerfreundlichkeit, aber mit begrenzter Darstellung des invasiven Wachstumsphänotyps, einem der Kennzeichen von Krebszellen. Aktuelle dreidimensionale (3D) Co-Kultursysteme erfordern entweder spezielle Ausrüstung oder separate Überwachung für die Invasion von ko-kultivierten Krebszellen und interagierenden T-Zellen.
Hier beschreiben wir einen Ansatz zur gleichzeitigen Überwachung des invasiven Verhaltens von Krebszellsphäroiden und T-Zell-Zytotoxizität in der Co-Kultur in 3D. Die Sphäroidbildung wird durch verbesserte Zell-Zell-Wechselwirkungen in gerüstfreien Agarose-Mikrowell-Gussteilen mit U-förmigen Böden angetrieben. Sowohl die T-Zell-Kokultur als auch die Krebszellinvasion in die Kollagenmatrix Typ I werden in den Mikrobrunnen der Agarose-Gussteile durchgeführt, ohne dass die Zellen übertragen werden müssen, wodurch ein intaktes 3D-Kokultursystem während des gesamten Assays erhalten bleibt. Die Kollagenmatrix kann von der Agarose-Umwandlung getrennt werden, was eine Immunfluoreszenz (IF) Färbung und eine konfokale Bildgebung von Zellen ermöglicht. Außerdem können Zellen für weiteres Wachstum isoliert oder Analysen wie Genexpression oder Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) unterzogen werden. Schließlich kann die 3D-Kokultur durch Immunhistochemie (IHC) nach Einbettung und Schnitt analysiert werden. Mögliche Modifikationen des Assays sind veränderte Zusammensetzungen der extrazellulären Matrix (ECM) sowie die Einbeziehung verschiedener stromaler oder Immunzellen in die Krebszellen.
Introduction
Trotz signifikanter Verbesserungen in der Krebsimmuntherapie in den letzten zehn Jahren ist unser mechanistisches Verständnis von Empfindlichkeit und Resistenz gegen Behandlungen immer noch ziemlich schlecht1. Es ist allgemein bekannt, dass Tumoren eine erhebliche Heterogenität aufweisen und dass die dynamischen Wechselwirkungen der Tumorzellen mit ihrer Mikroumgebung sowie mit den Immunzellen den Tod von Tumorzellen, das invasive Verhalten und die Reaktion auf Behandlungen beeinflussen, die immuntherapeutische1,2,3umfassen. Als ein Arm des adaptiven Immunsystems führen T-Zellen eine zellspezifische Zytotoxizität aus. Die Analyse der T-Zell-Erkennung und -Reaktion auf Krebszellen liefert mechanistische Einblicke in Resistenz und Empfindlichkeit gegenüber immunmodulatorischen Behandlungen.
Die In-vitro-Modellierung und Überwachung von Wechselwirkungen zwischen Krebs und T-Zellen in einer geeigneten Umgebung war eine Herausforderung und führte bisher zu begrenzten mechanistischen Erkenntnissen. Die meisten zellbasierten Assays basieren auf einer zweidimensionalen (2D) Umgebung, der es an Schlüsselmerkmalen mangelt, die für die Rekapitulation der dreidimensionalen (3D) in vivo Physiologie4,5,6, nämlich räumlichezell-zell-Interaktionen, Kontakt mit der extrazellulären Matrix (ECM)7, dynamischer metabolischer Nachfrage, erhöhter Hypoxie aufgrund des Massenwachstums8, und Auswirkungen der Tumormikroumgebung (TME)9sind. Auf der anderen Seite gibt es immer noch eine Reihe von Mängeln mit den derzeit verwendeten dreidimensionalen (3D) Kokultur- und Invasions-Assay-Systemen: (1) die zeitaufwändige Natur der Sphäroiderzeugung und -ernte5,10, (2) die fehlende Kontrolle über die Sphäroidgröße, Form und Zelldichte11,12, (3) die Low-Throughput-Typ-Assays, (4) die Anforderung für spezielle Ausrüstung13,14, (5) die Notwendigkeit, die Co-Kultur in verschiedene Umgebungen für verschiedene Assays übertragen15,16,17. Insbesondere die Übertragung eines Co-Kultur-Assays führt oft zu einer Störung der Sphäroide und zum Verlust der Integrität der Kokultur. Dies gilt insbesondere für “lockere” Sphäroide mit reduzierter Zellzellhaftung. Zum Beispiel erfordern die meisten 3D-Invasionstests, dass Sphäroide nach ihrer Erstausbildung geerntet und dann in ECM14,,15,16wieder ausgesetzt werden. Dieser Resuspensionsschritt führt zu einem Verlust der Kontrolle über den Abstand zwischen Sphäroiden. Da die Entfernung zwischen Tumorsphäroiden ihr invasives Verhalten beeinflusst, führt dieser Kontrollverlust zu einer hohen Inter-Assay-Varianz und reduziert die Reproduzierbarkeit. Darüber hinaus ist die Anwendung von Zellfraktionierungstests durch aufeinander folgende Zentrifugationsschritte zur Beurteilung der peripheren und Tumorsphäroid-infiltrierenden Immunzellen auf Tumorzellpopulationen beschränkt, die stabilere Sphäroiden erzeugen17.
Konzept und Ansatz
Unser Ansatz behebt die oben genannten Mängel mit einem “All-in-One”-3D-Sphäroid-Cokulturmodell, das die Übertragung von Sphäroiden für nachfolgende Assays nicht erfordert. Wir haben ein Sphäroid-Bildungsgerät (siehe Tabelle der Materialien) angepasst, um einen Assay zur gleichzeitigen Überwachung des invasiven Verhaltens von Krebszellen und der Zytotoxizität von ko-kultivierten T-Zellen zu generieren. Diese Methode ist benutzerfreundlich, kostengünstig und ermöglicht eine schnelle und einfache Handhabung in einer relativ hohen 3D-Einstellung. Je nach Art der verwendeten Vorrichtung können bis zu 81 große sphärische Sphäroide in einem einzigen Pipettierschritt mit Kontrolle über die individuelle Sphäroidgröße erzeugt werden, indem die Anzahl der ausgesäten Zellen geändert wird. Die Sphäroidbildung wird durch verbesserte Zell-Zell-Wechselwirkungen in gerüstfreien Agarose-Multi-Well-Gussteilen mit U-förmigen Böden erzwungen. Wir haben dieses 3D-System für dynamische zellbasierte Funktionsstudien sowie Endpunktmolekular- und biochemische Assays adaptiert, die fluoreszisaktivierte Zellsortierung (FACS), Immunfluoreszenz (IF) oder Immunhistochemie (IHC) Färbe sowie Genexpressionsanalyse der intakten 3D-Kokultur umfassen.
Für funktionelle Studienführt das Einbetten von Sphäroiden in Kollagen Typ I in die Agarose-Abgüsse zur Invasion von Krebszellen aus äquidistanten Sphäroiden und ermöglicht die Überwachung wesentlicher zelllinienspezifischer Merkmale, wie Z. I. kollektive Zellmigration18,19. Darüber hinaus lässt sich die Kollagenmatrix leicht vom Agaroseguss trennen, was zu einem 1,2222 mm dicken Pflaster mit mehreren Sphäroiden führt, das durch konfokale Mikroskopie für IF-Färbung und Bildgebung weiterverarbeitet werden kann. Dies kann deutliche Zellinvasion und Zell-Matrix-Wechselwirkungen in einem High-Throughput-Screening offenbaren. Auch Zellen in der Kollagenmatrix können nach Kollagenverdauung und Einzelzelldissoziation für die nachfolgende Zellkultivierung oder -analyse isoliert werden.
Für die IHC-Analyse von Sphäroidensind nach Fixierung und Schnitt der Agarose-Gussteile Proteine oder andere Moleküle von Interesse nachweisbar, während die geographischen Positionen der Sphäroide erhalten bleiben. In dem hier beschriebenen Ansatz werden Sphäroide direkt in Hydroxyethyl-Agarorose-Verarbeitungsgel in den Agaroseguss eingebettet und das Gel dient als “Deckel”, um die Sphäroide an der Unterseite der Mikrowells zu behalten. Nach der Paraffineinbettung der Agarose20wird eine serielle horizontale Schnitte mit der Unterseite des Gusses als Ausgangspunkt durchgeführt.
Dieser Ansatz steht im Gegensatz zu herkömmlichen IHC-Sektionen von Sphäroiden, die die Entnahme von Zellen vor der Einbettung in Hydroxyethyl-Agarose-Verarbeitungsgel21 erfordern und Gefahr läuft, Sphäroide zu stören, wodurch die räumliche Anordnung der Zellen verloren geht. Auch die Zellfraktionierung durch Zentrifugation zur Beurteilung, ob Immunzellen infiltriert oder peripher zu Tumorsphäroiden17 bleiben, wird durch direkte Einbettung vermieden.
Darüber hinaus kann die 3D-Kokultur durch Beimischung von Tumor-, Strom- oder Immunzellen durchgeführt werden und so Tumorzell-Übersprechen untersucht oder verschiedene Tumormikroumgebungen zur Analyse von Zell-Zell-Wechselwirkungen einschließlich Kokulturen mit Endothelzellen16rekapituliert.
Diese 3D-Sphäroid-Cokultur-Einstellung kann verwendet werden, um Co-Kultur verschiedener Zelltypen in der Tumormikroumgebung durchzuführen und die Auswirkungen veränderter ECM-Elemente zu bewerten. Neben Kollagen Typ I können auch andere ECM-Komponenten (z.B. Matrigel, Matrigel/Kollagen-Mischungen, Fibronectin) verwendet werden, da die Tumorzellinvasion durch die Fülle verschiedener Substrate beeinträchtigt wird22. Auch die Mikrobrunnen des Agarosegusses eignen sich für die Sphäroidbildung von Primärzelllinien und für Zellen mit geringer Zellzelladhäsion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier vorgestellte Methode beschreibt die 3D-Tumorsphäroid-Generierung, die eine Kokultur mit T-Zellen, zellbasierte funktionelle und molekulare Assays sowie eine Vielzahl von Überwachungs- und Analysemöglichkeiten mit einem einzigen Gerät ermöglicht. Der hauptvorteil unseres Ansatzes besteht darin, dass er keine Übertragung der 3D-Kultur auf einen separaten Assay erfordert und die Integrität der 3D-Kultur während der gesamten Assays aufrechterhält.
Der hier vorgestellte Workflow k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Virginie Ory, PhD für hilfreiche Diskussionen und Ratschläge zum Ansatz des 3D-Cokulturmodells. Wir danken auch Elizabeth Jones für die ausgezeichnete technische Unterstützung bei der IHC-Sektion. Diese Studie wurde durch Stipendien der DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) an YL (LI 2547/4-1) und der National Institutes of Health to AW (R01 CA231291), ATR (R01 CA205632), GWP (R01 CA218670) und des Core Grant of the Cancer Center (P30 CA51008) unterstützt.
Materials
| 3D Petri Dishes | Microtissues Inc | Z764019 & Z764051 | referred to as "rubber molds" in the protocols; 81-microwell & 35-microwell molds |
| 8-well Chamber Slides | Lab-Tek | 154534 | |
| Agarose Type I, low EEO | Sigma-Aldrich | A6013 | |
| anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody | Agilent | K4003 | ready to use |
| Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg | Millipore | 08-115 | |
| Collagenase Type 4, 1 g | Worthington | LS004188 | |
| DMEM, fetal bovine serum | ThermoFisher | 11965092, 16000044 | referred to as "cell culture medium" in the protocols |
| Harris hematoxylin | ThermoFisher | SH30-500D | |
| HistoGel | ThermoFisher | HG-4000-012 | referred to as "Hydroxyethyl agarose processing gel" in the protocols |
| Hoechst | Life Technologies | H1399 | 1/1000 dilution |
| Phalloidin 546 | Invitrogen | 486624 | 1/200 dilution |
| rabbit anti-CD8 antibody | Cell Signaling | 98941 | 1/25 dilution |
| rat anti-keratin 8 | DSHB | TROMA-I AB_531826 | 1/500 dilution |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | referred to as "RNA extraction kit" in the protocols |
| RPMI | ThermoFisher | 11875093 | for T-cell culture medium |
| Triton X-100 | BioRad | 1610407 | referred to as "Octoxynol" in the protocols |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | referred to as "guanidinium thiocyanate with phenol" in the protocols |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | referred to as "polysorbate 20" in the protocols |
| TypLE | ThermoFisher | 12604013 | referred to as "cell dissociation enzymes solution" in the protocols |
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