Summary
Her beskriver vi en metode for oppvarming av vitrifiserte humane blastocysts, culturing dem gjennom implantasjonsperioden in vitro, fordøye dem i enkeltceller og samle tidlige trophoblast celler for videre undersøkelse.
Abstract
Menneskelig implantasjon, apposisjon og vedheft til livmoroverflaten epitelia og påfølgende invasjon av blastocyst inn i mors decidua, er en kritisk, men gåtefull biologisk hendelse som har vært historisk vanskelig å studere på grunn av tekniske og etiske begrensninger. Implantasjon initieres ved utvikling av trophectoderm til tidlig trofoblast og påfølgende differensiering i distinkte trophoblast-underlinjer. Avvikende tidlig trophoblast differensiering kan føre til implantasjonssvikt, placentapatologier, føtale abnormiteter og abort. Nylig har metoder blitt utviklet for å tillate menneskelige embryoer å vokse til dag 13 post-befruktning in vitro i fravær av mors vev, en tidsperiode som omfatter implantasjonsperioden hos mennesker. Dette har gitt forskere muligheten til å undersøke menneskelig implantasjon og rekafulere dynamikken i trophoblast differensiering i denne kritiske perioden uten forvirrende mors påvirkninger og unngå iboende hindringer for å studere tidlige embryodilateringshendelser in vivo. For å karakterisere ulike trophoblast-underlinjer under implantasjon, har vi vedtatt eksisterende todimensjonale (2D) utvidede kulturmetoder og utviklet en prosedyre for å enzymatisk fordøye og isolere ulike typer trofoblastceller for nedstrøms analyser. Embryoer dyrket i 2D-forhold har en relativt flat morfologi og kan være suboptimal i modellering in vivo tredimensjonale (3D) embryonale arkitekturer. Trophoblast differensiering synes imidlertid å være mindre påvirket som demonstrert av forventet morfologi og genuttrykksendringer i løpet av utvidet kultur. Ulike trophoblast underordnede, inkludert cytotrophoblast, syncytiotrophoblast og trekktrophoblast kan skilles etter størrelse, plassering og temporal fremvekst, og brukes til videre karakterisering eller eksperimentering. Undersøkelse av disse tidlige trofoblastcellene kan være medvirkende til å forstå menneskelig implantasjon, behandle vanlige placentapatologier og redusere forekomsten av graviditetstap.
Introduction
Menneskelig implantasjon og fremveksten av den tidlige morkaken er historisk vanskelig å undersøke og forblir i stor grad ukjent fordi menneskelig vev er utilgjengelig på dette stadiet når graviditet er klinisk umulig å oppdage. Dyremodeller er utilstrekkelige, da menneskelig placentation har sine egne unike egenskaper sammenlignet med andre eutherian pattedyr. For eksempel invaderer menneskelig placenta dypt inn i decidua med noen trophoblastceller som når minst den indre tredjedelen av livmormyometriummens andre celler omformer livmorspiralarteriene. Selv våre nærmeste evolusjonære forfedre, de ikke-menneskelige primater, viser forskjeller i placenta morfologi og trophoblast interaksjoner med mors decidual vev1,,2,,3. Å oppnå preimplantasjon humane embryoer in vitro var ikke mulig før på 1980-tallet da klinisk human in vitro befruktning (IVF) startet som en rutinemessig praksis for behandling av infertilitet4. Nå kan menneskelige blastocysts dyrkes in vitro for å tillate valg av mer levedyktige embryoer for overføring, samt muliggjøre sikker genetisk testing. Forbedring i embryokulturteknikker, samt den økende bruken av IVF har gitt mange overskuddsblastocyster som gjenstår etter at pasientens behandlingssykluser er fullført. Med pasientens samtykke, IRB-godkjenning, og med visse restriksjoner, kan disse blastocystene brukes til forskningsstudier. De har blitt en uvurderlig ressurs som ble brukt til avledning av humane embryonalestamceller 5,forstå overgangen av indre cellemasse til embryonalestamceller 6,7,og mer nylig, har blitt vellykket dyrket til dag (D) 13 å ombygge menneskelig implantasjon8,9. Ved å bruke nylig utviklede encellede omics tilnærminger, har tilgangen til disse implantasjonsstadiet menneskelig embryovev tilbudt unike muligheter til å beskrive molekylære mekanismer som regulerer denne svært dynamiske cellediensisjonsprosessen, som tidligere var umulig åutforske 10,11,12,13.
Her beskriver vi metodene som brukes i vår nylige publikasjon som karakteriserer dynamikken i trofoblastdilatering under menneskelig implantasjon12. Denne protokollen inkluderer oppvarming av vitrifiserte blastocysts, utvidet embryokultur opp til D12 post IVF, enzymatisk fordøyelse av embryoet i enkeltceller, og cellesamling for nedstrøms analyser (figur 1). Dette utvidede kultursystemet støtter peri-implantasjonsstadium menneskelig embryoutvikling uten mors innspill og rekavalerer trophoblast differensiering som ser ut til å være i samsvar med observasjonene fra histologiske prøver for mange årsiden 14,15,16,17. Under implantasjon består trofoblastpopulasjonen av minst to celletyper: mononuklet stamcellelignende cytotrophoblast (CTB) og terminalt differensiert, multinuklert syncytiotrophoblast (STB). Ved trypsin fordøyelsen er CTB små, runde celler som er morfologisk umulig å skille fra andre cellelinjer (Figur 2A, venstre panel). Separasjon av CTB fra andre cellelinjer, som epiblast og primitiv endoderm, kan oppnås ved deres distinkte transkripsjonsprofiler avslørt ved encellede RNA-sekvensering. Syncytiotrophoblast celler kan lett identifiseres som uregelmessige formede strukturer som er betydelig større enn de andre celletypene og hovedsakelig ligger i periferien av embryoet (Figur 2A, midtpanel; Figur 2B, venstre panel). Trekkfugl trophoblastceller (MTB) er en annen trophoblast sublineage funnet under embryo utvidet kultur og kan gjenkjennes som tilsynelatende beveger seg bort fra hoveddelen av embryoet (Figur 2A, høyre panel, Figur 2B, høyre panel). Trekktrophoblast, selv om de uttrykker mange av de samme markørene som ekstra villous trophoblast (EVT), bør ikke refereres til som EVT, siden de villelige strukturene i morkaken ikke har dukket opp på dette svært tidlige utviklingsstadiet.
Eksperimentelt var vi i stand til å samle små CTB og store STB som er lett skilles etter embryoer er fordøyd i enkeltceller ved D8, D10, og D12 (Figur 2A, B). Trekktrofoblaster oppstår i de senere stadiene av utvidet embryokultur og kan samles ved D12 før enzymatisk fordøyelse av hele embryoet (figur 2A, B). Ved å fenotypisk skille disse tre trophoblast-underlinjene før enkeltcelleanalyse, kan vi identifisere spesifikke transkripsjonsmiske markører og definere den biologiske rollen til hver celletype. Cytotrophoblast er svært proliferative og fungerer som stamceller i å levere STB og MTB differensierteavstamninger 10,,11,,12,,13. Syncytiotrophoblast er involvert i å produsere placentahormoner for å opprettholde graviditet og kan også være ansvarlig for embryoene som graver seg inn i endometrium10,11,12,13. Trekkfugltrophoblast har enda sterkere trekk ved en invasiv, migrerende fenotype og er sannsynligvis ansvarlig for dypere og mer omfattende kolonisering av livmoren endometrium10,11,12,13. Etter å ha definert transkripsjonssignaturen for hver celletype, har klyngeanalyser også avdekket to ekstra undergrupper av celler som var morfologisk umulig å skille fra CTB og hadde transkripsjoner med funksjoner i STB og MTB,henholdsvis 12. Disse mellomliggende fasecellene er sannsynligvis i ferd med å differensiere fra CTB til enten MTB- eller STB-underlinjene og ville ha blitt oversett hvis embryoer ble blindt fordøyd og cellene ble separert av transkripsjon alene.
Protokollen som er beskrevet her benytter et todimensjonalt (2D) kultursystem og er kanskje ikke optimal for å støtte tredimensjonal (3D) strukturell utvikling, som foreslått av en nylig publikasjon som beskriver et nyutviklet 3D-kultursystem13. Likevel, i dette 2D-systemet differensiering av tidlig trofoblast synes å være i samsvar med observasjoner gjort fra in vivo prøver14,15,16,17. Denne protokollen kan også enkelt tilpasses bruken i det nylig beskrevne 3D-kultursystemet13 med minimale endringer. Alle trinnene utføres med en håndholdt mikromanipuleringpipette med kommersielt tilgjengelige engangsspisser eller en munnpipette fra en fin trukket glasspipette festet til gummirør, et filter og et munnstykke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle menneskelige embryoer har blitt donert med samtykke til bruk i forskning. Protokoller for utvidet menneskelig embryokultur er godkjent av Western Institutional Review Board (studie nr. 1179872) og følger internasjonale retningslinjer. Enhver bruk av menneskelige embryoer må gjennomgås av de aktuelle etiske og styrende organer knyttet til forskningsinstitusjonen ved hjelp av denne protokollen.
1. Forberedelse
- Forbered media og restitusjonsplater en dag før embryooppvarming i en steril laminær strømningshette.
- Forbered 2 ml blastocyst kulturmedier (BM) med 10 % v/v serumproteinerstatning (SPS).
MERK: Blastocyst kulturmedier kan eller ikke inneholde tilsatt protein. Her brukte vi et medium som må suppleres med 10% av det angitte albuminproteinet. Se produsentens veiledning for variasjon i denne tillegget. Alle medier skal filtreres med et sterilt 0,22 μM filter festet til en steril sprøyte før likevekt. - Fyll to senter-brønnorgankulturvaskeretter med 500 μL BM med 10% v / v SPS dekket med 500 μL embryokulturklasseolje.
- I en 60 mm vevskulturrett, lag 8 ml embryokulturolje og deretter forankre 20 μL dråper BM med 10% v / v SPS til bunnen av kulturplaten. Lag 1 dråpe for hvert embryo oppvarmet.
MERK: Flere medier, dråper og oppvask kan gjøres etter behov. Dråper kan også legges til parabolen før oljen er lagdelt. Forankringsfall under oljen vil bidra til å redusere fordampning og eventuelle påfølgende endringer i osmolalitet. - Likevekt BM med 10% v / v SPS vaskeretter og utvinning plate i en inkubator ved 37 ° C, 6% CO2, 5% O2 i minst 4 timer.
- Tin ett hetteglass med det første trinnet av utvidet kulturmedier (IVC1) i 4 °C eller på benketoppen.
- Forbered en vaskerett på 500 μL IVC1 uten oljeoverlegg. Aliquot ca 4 ml IVC1 i en 5 ml snap cap tube.
- Likevekt IVC1 vaskeskål og et lite smekkrør på IVC1 i 37 °C, 6 % CO2 og atmosfærisk O2 i minst 4 timer.
- Forbered 2 ml blastocyst kulturmedier (BM) med 10 % v/v serumproteinerstatning (SPS).
- Forbered utvidede kulturplater en dag før embryooppvarming i en steril laminær strømningshette.
- Fortynn fibronectin fra humant serum i fosfatbufret saltvann (PBS) til 30 μg/ml. 250 μL på 30 μg/ml fibronectin per embryo vil være nødvendig for å belegge kamrene.
- Åpne 8 godt kamret dekkglass pakke under panseret mens du tar vare på ikke å røre brønnene. Pipette 250 μL forsiktig på 30 μg/ml fibronectin i hver brønn.
- Sett lokket tilbake på den kamret dekkslippen og plasser det i 4 °C i 20-24 timer.
- Forbered utvidet kulturplate om morgenen av embryooppvarming.
- Hent den kamret dekkslippen med fibronectin og plasser i laminær strømningshette. Fjern fibronectinblandingen med en 1 ml pipette og kast den i avfallsbeholderen.
- Hent oppvarmede, likeverdige IVC1-medier fra et lite 5 ml smekkhetterør.
- Pipette 300 μL av likevektig IVC1 i hver brønn. Vær forsiktig så du ikke lar væske berøre lokket, da dette vil øke risikoen for forurensning.
- Returner den kamret dekkslips med IVC1 for å inkubere i 37 °C, 6 % CO2 og atmosfærisk O2 til fjerning av zona pellucida i trinn 4.
2. Oppvarming vitrifisert D5 menneskelige embryoer
MERK: Andre produsenter kan ha litt forskjellige protokoller i henhold til sin egen vitrifiseringsteknologi. Se produsentens bruksanvisning når det er aktuelt.
- Varm 3,0 ml tineoppløsning (TS) i 35 mm fatet til 37 °C. Ta med 300 μL fortynningsoppløsning (DS) og to brønner på 300 μL vaskeoppløsning (WS) i en 6 brønnplate til romtemperatur.
- Bruk tang, fjern forsiktig kryoenhetshylsen samtidig som det vitrifiserte embryoet alltid forblir under flytende nitrogen.
- Flytt raskt kryoenheten fra flytende nitrogen og stup spissen av kryoenheten i TS ved 37 °C. Still inn en timer i 1 min og hold kryoenheten nedsenket til embryoet løsner i TS.
MERK: Varme embryoer ett om gangen for å holde styr på embryoidentiteter som de kan forholde seg til pasientdemografisk informasjon i nedstrøms analyse. - Under 1 min inkubasjon i TS, fjern forsiktig kryoenheten og ta forsiktig opp embryoet og flytt til motsatt side av TS-parabolen.
MERK: Hvis du dyrker flere embryoer, må du være flittig for å holde embryoene atskilt for å sikre at riktige identiteter opprettholdes. - Etter 1 min, forsiktig plukke opp embryoet med en liten mengde TS, ca 2 μL. Flytt embryoet til bunnen av 300 μL DS godt mens du dekker embryoet i et tynt lag av TS fra pipetten. Still inn en timer i 3 min og plasser 6-brønnsplaten på benketoppen ved romtemperatur.
- Etter 3 min, plukk opp embryoet med en liten mengde DS, ca 2 μL, og flytt embryoet til bunnen av neste brønn som inneholder 300 μL av WS. Igjen, lag forsiktig en liten mengde DS fra pipetten over embryoet. Still inn en timer i 5 min og gå tilbake til benketoppen.
- Etter 5 min, plukk opp embryoet med minimalt volum av WS og gå til toppen av den endelige brønnen på 300 μL WS. Embryoet vil sakte falle og vaske gjennom WS til bunnen. Utvis eventuelle beholdte WS fra pipetten til en tom brønn.
- Plukk opp embryoet med minimalt volum og gå tilbake til toppen av den samme 300 μL brønnen av WS. Embryoet vil igjen falle til bunnen av brønnen. Sett en timer i 1 min og sett 6-brønnsplaten tilbake til benkeplaten.
3. Gjenoppretting av oppvarmede embryoer
- Ett om gangen, flytt oppvarmede embryoer inn i en senterbrønnorganvevsrett som inneholder 500 μL likeverdig BM med 10% v / v SPS under 500 μL av likeverdig embryokulturklasseolje.
- Vask embryoer ved å plukke opp hvert embryo og flytte dem rundt til flere områder i parabolen mens du blåser ut gamle medier mellom trekk. Plukk opp embryoet og flytt det til en individuell 20 μL kultur dråpe av likeverdig BM med 10% v / v SPS under olje.
- La de oppvarmede embryoene komme seg i 2 timer i en inkubator ved 37 °C, 6 % CO2, 5 % O2.
4. Fjerning av Zona
- Etter en 2 t utvinning, vurdere embryoer for re-utvidelse og ta bilder av hvert embryo.
- Flytt embryoer individuelt i 500 μL av et 3-(N-morpholino)-propansulfonic acid (MOPS)-bufret håndteringsmedium med 5% (v / v) fosterkalvserum (FCS) før behandlingen med sur Tyrodes løsning.
- Flytt ett embryo raskt gjennom 300 μL av oppvarmet sur Tyrodes løsning mens du aktivt ser gjennom mikroskopet. Zona pellucida vil visuelt begynne å oppløse. Dette vil ta ca 5 s.
- Flytt umiddelbart embryoet med oppløsning av zona i 300 μL med oppvarmet MOPS bufret medium for å slukke syrtyodens løsning.
- Flytt embryoet med minimalt volum mops bufret medium inn i en senterbrønnorganvevsrett som inneholder 500 μL likeverdig BM med 10% v / v SPS under 500 μL av likeverdig embryokulturklasseolje å vaske.
- Returner embryoet til 20 μL utvinningsfallet fra trinn 3.2.
MERK: Ved visuell undersøkelse etter fjerning av zona kan eventuelle embryoer med beholdt zona pellucidae behandles ytterligere med sur Tyrodes oppløsning om nødvendig ved å gjenta trinn 4.2-4.6. Det er ønskelig å minimere eksponering for Tyrodes løsning.
5. Blastocyst utvidet kultur
- Flytt embryoene individuelt til vaskefatet med likevektsmedier fra trinn 1.1.6. Flytt forsiktig ett embryo til en brønn av den kamret dekkslips med likevekt IVC1 og opprettholde embryo identifikasjon.
MERK: Dette trinnet må være ferdig så raskt som mulig for å minimere middels fordampning. - Returner kamret dekkslips til en inkubator satt til 37 °C, 6 % CO2, atmosfærisk O2 i 2 dager.
MERK: Pass på å tine og likevektsmedier i 37 °C, 6 % CO2, atmosfærisk O2 for medieutvekslingen 4 timer på forhånd. - Ved utvekst D2 (D7 etter befruktning), nøye undersøke vedlegg av embryoer under mikroskopet og utføre medieutveksling.
- Legg merke til hvilket embryo som er festet til parabolen før du bytter media. Bank forsiktig på platen og undersøke om et embryo er godt festet til platen under mikroskopet.
- Fjern lokket og fjern forsiktig 150 μL IVC1 og kast mens det ikke forstyrrer det vedlagte embryoet. Hvis et embryo ennå ikke er festet til platen, må du ikke bytte media, da serumet i IVC1 vil hjelpe til med embryotilbehør.
- Pipette 150 μL av likevektsutvidede kulturmedier, IVC2, sakte inn i hver brønn og sett lokket tilbake til den kamret dekkslippen.
MERK: Pass på at det minimeres at det er minimert å fjerne lokket fra den kamret dekkslipsen for å unngå middels fordampning.
- Sett forsiktig den kamret dekkslipsen forsiktig tilbake til inkubatoren uten å sprute noe media på lokket. Gjenta medieutveksling og vedleggskontroll hver dag med utvidet kultur til embryoer er klare for fiksering eller enkeltcellefordøyelse.
6. Valgfri samling av brukte medier
- Eventuelt samle brukte medier under utveksling av kulturmedier etter D7 eller en dag etterpå. Under trinn 5.3.2, i stedet for å kaste medium snap-fryse 150 μL fjernet IVC1 i en steril, lav-bind 0,5 ml rør for fremtidig analyse.
7. Valgfri fiksering for immunofluorescence
- Bruk en 200 μL pipette til å vaske embryoer med 1/2 medieutveksling av PBS for 3x før fiksering for å fjerne ekstracellulært avfall. Vasking av overflødig rusk og protein vil bidra til å optimalisere klarhet og redusere bakgrunnen i bilder oppnådd med immunofluorescence.
- Fjern alle medier og tilsett sakte 200 μL med 4 % paraformaldehyd (PFA) i PBS til brønnen. Embryoet vil ønske å holde seg til overflaten av væsken. Flere 150 μL vasker med 4% PFA før du fjerner all væske vil bidra til å minimere eventuelle skader på embryoet.
- Inkuber embryoene i 4% PFA i 20 min for fiksering.
- Vask embryoer 3x i 10 min per vask med 200 μL på 0,1% v / v polysorbat 20 i frisk PBS.
- Oppbevar faste embryoer i 0,1 % v/v polysorbat 20 i PBS ved 4 °C før du fortsetter med immunofluorescence-protokollen.
8. Encellefordøyelse med Trypsin
MERK: Friske (ikke faste) embryoer brukes til fordøyelse av én celle.
- Vask embryoet en gang med 200 μL PBS og tilsett 200 μL trypsinløsning til hver brønn. Sett den kamret dekkslipsen tilbake til inkubatoren i 5 min.
- Fjern den kamrede dekkslippen fra inkubatoren og undersøk embryoene under et stereoskop. Celler i periferien av embryoet vil begynne å trekke seg tilbake og MTB bør fortsatt festes til platen der de er eksternt plassert fra embryoet.
- Bruk en liten pipette eller finst trukket munnpipette for å plukke opp individuellE MTB før du bryter fra hverandre hele embryoet. Hopp fremover til trinn 9.1 for å lagre MTB og gå tilbake til trinn 8.4 etter trinn 9.3.
- Bruk en håndholdt mikromanipuleringpipette eller munnpipette til å forsiktig dissosiere embryoet ved å aspirere opp og ned.
- Celler vil begynne å ta avstand fra hele embryoet. Fortsett å aspirere embryoet forsiktig og gjentatte ganger ved hjelp av en pipettespiss med mindre diameter eller munnpipetten til embryoet er inkubert i totalt 10 min i trypsin.
9. Enkeltcellevalg og prøvesamling
- Med minimal trypsin, flytt de dissosierte cellene gjennom tre vaskedråper på 20 μL PBS + 0,1% polyvinylpyrrolidon (PVP) under embryokulturolje med forsiktighet for ikke å miste noen celler.
- Etter å ha vasket cellene, bruk en fin trukket glasspipette for å velge en celle. Pipette enkeltcellen forsiktig inn i et sterilt 0,2 ml lavbindingsrør med minimalt volum PBS+0,1 % PVP.
- Fest fryse enkeltceller i flytende nitrogen (LN2), og oppbevares i -80 °C for fremtidig bruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Friske embryoer viste fortsatt spredning i løpet av utvidet kultur (Figur 2B). Unormale embryoer begynte å trekke seg tilbake fra sine ytre kanter og gå i oppløsning (figur 2C). Fra vår erfaring ble ca 75% av embryoene festet til bunnen av fibronectin belagt parabolen ved 48 timer og vedlegget økte til ca 90% av 72 timer i kultur. Suksessen til embryovedlegg kan i stor grad påvirkes av den opprinnelige kvaliteten på blastocysts. Embryoer som ikke er festet av 72 h sannsynligvis ikke vil overleve.
Ved D8 etter befruktning (D3 av utvidet kultur) var de fleste cellene i embryoene CTB som var positive for trofoblastmarkøren GATA3 (figur 3A). Cytotrophoblaster hadde allerede begynt å differensiere til multinukleated STB i periferien av embryoet (Figur 2B, venstre panel, stiplet linje). Disse STB hadde et arklignende utseende og var farget positivt for den menneskelige choriongonadotropin subunit beta (hCGB; Figur 3A, midtpanelet). Embryoene vokste raskt, mellom D8 og D10, noe som tyder på en rask cellespredning av CTB i denne perioden. Ved D10 var dannelsen av CGB positiv MTB maksimalt, noe som kan bekreftes ved oppsvinget av hCG-produksjonen på dette tidspunktet (figur 3B). Trekkfugler begynte også å dukke opp og migrerte bort fra embryokroppen og ble farget positivt for EVT-markøren, HLA-G (figur 3A, høyre panel). Ved D12, STB differensiering var i nedgang og MTB produksjonen ble mer fremtredende, noe som tyder på et skifte av vekt fra hormonproduksjon på D10 til celle migrasjon på D12. Disse endringene ble observert av time-lapse video innhentet i løpet av denne peri-implantasjonsperioden (Film 1). Våre enkeltcellede RNA-sekvenseringsdata reflekterte også slike dynamiske endringer i cellefunksjonen. Sammen antyder disse dataene tidlig trophoblast differensiering, og fremveksten av den tidlige morkaken er en dynamisk prosess, der embryoet kan prioritere høyt spesialiserte cellefunksjoner på svært spesifikke tidspunkter for å oppnå vellykket implantasjon.
Figur 1: Prosedyreskjematisk for utvidet kultur og enkeltcelleprøvesamling.
Arbeidsflyt for oppvarming av vitrifiserte embryoer, fjerning av zona pellucida, utvidet embryokultur, enzymatisk fordøyelse og isolering av cytotrophoblast (CTB), syncytiotrophoblast (STB) og trekktrophoblast (MTB). Dette tallet er endret fra West et al.12. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Morfologier av trofoblastceller og embryoer under utvidet kultur.
(A) Representative bilder av forskjellige trophoblast celletyper etter enzymatisk fordøyelse med trypsin. Liten CTB til venstre, stor STB i midten og MTB til høyre. (B) Representative bilder av friske embryoer ved D8 (venstre), D10 (midten) og D12 (høyre). Stiplede linjer i venstre panel disposisjon antagelig proliferativ CTB befolkningen mens stiplet linje skisserer flate STB. Rosa sirkler i høyre panel disposisjon MTB som var eksternt plassert fra embryoet. (C) Representative bilder av unormale embryoer begynner å trekke seg tilbake og gå i oppløsning ved D8 (venstre), D10 (midten) og D12 (høyre). Vektstenger = 200 μm. Noen bilder er tilpasset fra West et al.12. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative bilder av trophoblastmarkøruttrykk og hCG-produksjon under utvidet kultur.
(A)Representative immunofluorescence bilder av embryoer som viser uttrykk for en CTB markør GATA3 ved D10 (venstre), STB markør CGB ved D10 (midten), og MTB markør HLA-G ved D12 (høyre). Vektstenger= 200 μm. (B) Representativ hCG-konsentrasjon (mIU/ml) i løpet av utvidet kultur fra D8 til D12 (gjennomsnittlig± SEM, n = 3). Statistisk analyse ble utført med enveis ANOVA etterfulgt av Tukeys test (P < 0,05). Disse bildene er tilpasset fra West et al.12. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Film 1: Time-lapse video av et menneskelig embryo i utvidet kultur fra D8 til D12. Videoen viser sammenbruddet av blastocoel, dannelsen av STB (indikert av de grønne sirkler), og deretter eventuell differensiering og migrering av MTB (indikert av de oransje sirkler). Dette er tilpasset fra West et al.12. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utviklingen av protokollen til kultur menneskelige embryoer gjennom implantasjon har tillatt forskere å utforske en tidligere ukjent tid i utvikling8,9. Her bruker vi et utvidet kultursystem for å dyrke menneskelige embryoer og studere tidlig trophoblast differensiering før dannelsen av vill. Metodene som er beskrevet her tillater oss å samle forskjellige TB-underlinjer for bruk i nedstrøms encelleanalyse. Dette arbeidet gir det vitenskapelige samfunnet en sjanse til å forstå denne kritiske og gåtefulle perioden i menneskelig utvikling, og kan åpne nye muligheter for terapeutiske behandlinger for abort eller andre placentapatologier som pre-eclampsia, samt gi ny innsikt om tidlig menneskelig utvikling.
Denne protokollen krever ferdigheter i raskt manipulering av embryoer under embryooppvarming, fjerning av zona og plating for å minimere embryostress før utvidet kultur. Minimere mediefordampning og dermed en økning i middels osmolalitet ved å begrense eksponeringstiden under medieutveksling er avgjørende. Å ta vare på å bruke riktig aseptisk teknikk når du bytter mellom og bevegelige retter vil bidra til å minimere forurensning. Stabilisering av parabolen når den er i bruk for å minimere mekanisk forstyrrelse når embryoer har festet er også viktig. Embryoer som blir stresset vil begynne å trekke tilbake sine syncytial projeksjoner og begynne å apoptose. Det er også avgjørende å unngå å la menisken i kulturmediene berøre overflaten av embryoet, og for å minimere olje i brønnene. En av disse scenariene kan ødelegge embryoet.
Å dyrke menneskelige embryoer utenfor blastocyst-scenen er et raskt voksende felt. En nyligstudie 13 viste at et nytt kultursystem som inneholder 10% av en ekstracellulær matriseproteinblanding og et medium med ekstra tilskudd av natriumpyuvat, laktat og rho-associate protein kinase (ROCK) hemmer er en fordel i modellering in vivo 3D embryonale arkitekturer og ga betydelig mer levedyktige embryoer på senere stadium av utvidet kultur sammenlignet med det utvidede kultursystemet beskrevet her. Validering av dette nye systemet for å demonstrere reproduserbarheten vil være nødvendig. Vi tror prosedyrene som er beskrevet her kan tilpasses dette nye 3D-systemet med mindre endringer og kan derfor dra nytte av utviklingen i metodikk på dette feltet.
Denne protokollen kan også tilpasses for å tillate undersøkelse av IVF kultur media optimalisering. Vi har nylig vist at i mus kan embryoutvikling under utvidet kultur forutsi suksessen til fosterutvikling etter embryooverføring18. Unormalt befruktede og kasserte menneskelige zygotes med 3 pronuclei (PN) kan dyrkes til blastocysts på D5 under forskjellige forhold som deretter kan påvirke deres utvikling under utvidet kultur. Donerte D5 menneskelige blastocysts kan bli dyrket i 48 timer i nye forhold før de blir plassert inn i det utvidede kultursystemet for prestasjonsevaluering. Rutinemessige målinger av epiblastcellenummer, totalt cellenummer, utvekstområde og hCG har gjort det mulig for laboratoriet vårt å bedre forstå hvordan ulike kulturmedieforhold bedre kan støtte menneskelig preimplantasjonsembryoutvikling og påvirke deres suksess etter implantasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi ønsker å anerkjenne de mange pasientene ved Colorado Center for Reproductive Medicine (CCRM) som nådig har donert sine embryoer for forskning. Vi vil også takke Karen Maruniak og det kliniske laboratoriet ved CCRM for deres hjelp til å behandle hCG-prøver, samt Sue McCormick og hennes kliniske IVF embryologiteam ved CCRM for deres hjelp med embryoinnsamling, lagring, sporing og donasjon. Finansieringen ble gitt internt av CCRM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NORM JECT Luer Lock sterile syringe | VWR | 53548-019 | Pack of 100 |
| 3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| 35 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 62406-038 | Case of 500 |
| 5 mL snap cap tube | VWR | 60819-295 | Pack of 25 |
| 60 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 25382-687 | Case of 200 |
| 6-well dish | Agtech Inc. | D18 | Pack of 1, 10, or 50 |
| Acidic Tyrode's solution | Millipore Sigma | T1788 | 100 mL |
| Biotix 1250 µL pipette tips | VWR | 76322-156 | Pack of 960 |
| Blast, blastocyst culture media | Origio | 83060010 | 10 mL |
| Dilution Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Thermo Fisher Scientific | 1367820D | 5.75 in. (146mm); 720/Cs |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Millipore Sigma | D8537 | |
| Embryo culture paraffin oil OvOil | Vitrolife | 10029 | 100 mL |
| Eppendorf PCR tubes 0.2 mL | VWR | 47730-598 | Pack of 1,000 |
| Eppendorf PCR tubes 0.5 mL | VWR | 89130-980 | Case of 500 |
| Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution | Millipore Sigma | F0895 | 1 mg |
| Gilson 1 mL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 200-1000 µL |
| Gilson 20 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 2-20 µL |
| Gilson 200 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 50-200 µL |
| G-MOPS handling media | Vitrolife | 10129 | 125 mL |
| Handling media | Origio | 83100060 | 60 mL |
| Ibidi 8 well chambered coverslip | Ibidi | 80826 | 15 slides per box |
| IVC1/IVC2 | Cell Guidance Systems | M11-25/ M12-25 | 5-5mL aliquots |
| K System T47 Warming Plate | Cooper Surgical | 23054 | |
| MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane | Fisher Scientific | SLGVR33RS | Pack of 50 |
| Mouth pieces | IVF Store | MP-001-Y | 100 pieces |
| Oosafe center well dish | Oosafe | OOPW-CW05-1 | Case of 500 |
| Quinn's Advantage SPS | Origio | ART-3010 | 12x 12 mL |
| Rubber latex tubing for mouth pieces | IVF Store | IVFS-NRL-B-5 | 5 ft. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | |
| Stripper tips | Cooper Surgical | MXL3-275 | 20/pk 275 µm |
| Thawing Solution | Kitazato | VT802 | 2 x 4 mL |
| The Stripper Micropipetter | Cooper Surgical | MXL3-STR | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | 1 x 100 mL |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-25ML | 25 mL bottle |
| VWR 1-20 µL pipette tips | VWR | 76322-134 | Pack of 960 |
| VWR 1-200 µL pipette tips | VWR | 89174-526 | Pack of 960 |
| Washing Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
References
- Carter, A. M. Animal models of human placentation--a review. Placenta. , Suppl A 41-47 (2007).
- Carter, A. M., et al. Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report. Placenta. 27, 30-33 (2006).
- Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals. Placenta. 2, 71-91 (1981).
- Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro. Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- O'Leary, T., et al. Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation. Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).
- O'Leary, T., et al. Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate. Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
- Deglincerti, A., et al. Self-organization of the in vitro attached human embryo. Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).
- Zhou, F., et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).
- Lv, B., et al. Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses. PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).
- West, R. C., et al. Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos. Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).
- Xiang, L., et al. A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos. Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).
- Mall, F. P. Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university. The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).
- Buettner, K. A. Franklin Paine Mall (1862-1917). Embryo Project Encyclopedia. , (2007).
- Carnegie Institution of Washington. Contributions to embryology. , Carnegie Institution of Washington. Washington, D.C. (1915).
- Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. A description of 34 human ova within the first 17 days of development. American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).
- Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).
