マウス切除創傷治癒モデルと組織形態学的創傷解析
Summary
このプロトコルは、マウスで両側の完全な厚さの切除傷を生成する方法と、その後、形態測定分析のために創傷を監視、収穫、および準備する方法を記述する。これには、シリアル組織学的セクションを使用して形態異常を定義、正確に定量化、検出する方法の詳細な説明が含まれています。
Abstract
マウスの外皮創傷モデルは、創傷治癒の順次重なり合う相(炎症、増殖および改造)のそれぞれを研究するために広く使用されてきた。マウスの創傷は、治癒プロセスのこれらの異なる段階が測定可能である組織学的に明確かつ容易に認識可能な創傷床を有する。フィールド内では、組織学的分析のために任意に定義された創傷の「中間」を使用することが一般的です。しかし、創傷は三次元の実体であり、しばしば組織学的に対称的ではなく、小さな効果サイズで形態異常を検出するための明確かつ堅牢な定量方法の必要性を支持する。本プロトコルでは、マウスにおける二国間の全厚切除創傷を作成するための手順と、選択したシリアルセクションの画像処理プログラムを用いて形態測定パラメータを測定する方法についての詳細な指示を説明する。創傷長さ、表皮長さ、表皮領域、および創傷領域の2次元測定は、創傷、全体的な創傷領域、表皮容積および創傷容積を覆う3次元表皮領域を外挿するために、断面間の既知の距離と組み合わせて使用される。この詳細な組織学的分析は、従来の分析よりも時間とリソースの消費が多いが、その厳格さは、本質的に複雑な創傷治癒プロセスで新しい型を検出する可能性を高める。
Introduction
皮創傷治癒は、連続的に重なる相を有する複雑な生物学的プロセスである。損傷した上皮のバリア機能を回復させるためには、時間的および空間的に調節される細胞および分子プロセスの調整が必要です。第1段階では、炎症、好中球およびマクロファージが創傷に移行し、局所防御および全身防御を動員する。炎症期に続いて重なり合うのが増殖段階である。線維芽細胞は急速に増殖し、造粒組織に移行し始める。先導端から離れた角化細胞は、前縁の分化された角化細胞が創傷2を再上皮化するために移行するとして、創傷に向かって方向に増殖する。最後に、造粒組織の線維芽細胞がコラーゲンを合成して沈着し始める間に、再造形および成熟相が始まる。新しいマトリックスの改造と組織は、怪我の後に1年まで続くことができます 3.複数の細胞タイプ間のクロストークを伴う重複する事象の複雑さにより、長年の研究にもかかわらず、創傷治癒の根底にある細胞および分子メカニズムの多くは十分に理解されていない。
マウスモデルは、使用の容易さ、比較的低コスト、遺伝的操作性1、4、5による創傷治癒のメカニズムを調査するための主要な哺乳類モデルである。マウスモデルには異なるタイプの創傷が記載されているが、最も一般的なのは切除創傷(両側性パンチまたは直接パンチ生検のいずれか)であり、続いて切開創傷モデル4が続く。切除創傷モデルは、癒しのプロセスを経ていない制御組織を本質的に生成するため、切開モデルに対して明確な利点があります。外科プロトコルの一部として切除されるパンチ生検組織は、傷ついた組織と同様に処理し、所望の基準のための恒食状態を確立するために使用することができる。切除された対照組織は、皮膚前処理の効果を評価する場合や、傷害時に遺伝子改変が成功したことを確認する場合にも有用である。
治癒パラメータは、平面測定やヒストロジーを含む多くの異なる技術によって評価することができる。しかし、プラニメトリーは創傷の目に見える特性しか評価できないし、また、かさぶたの存在のために、しばしば、占いが可視化される治癒の測定値と相関しない、それによって、構造学を分析4の「ゴールドスタンダード」にする。組織学的分析はゴールドスタンダードであるにもかかわらず、最も頻繁に創傷の任意のサブセット6,7で行われる。例えば、創傷を埋め込み、切断する前に「半分」に創傷を切断することは、材料の切断およびデータ分析に費やされる時間とリソースを削減するために現在一般的な習慣である。このプロトコルに記載された形態測定解析の方法は、創傷組織全体を包含し、創傷の形態学的特徴を正確に反映し、小さな効果サイズで創傷治癒欠陥を検出する可能性を高めるために開発された。このプロトコルでは、最も一般的に研究されているマウス創傷、両側の完全な厚さの切除傷を生成するための外科的方法、ならびにそのような組織学的分析のための詳細かつ厳格な方法が現場ではほとんど使用されない。
Protocol
Representative Results
Discussion
両側切除創傷モデルは、創傷治癒の多くの異なる側面を研究するために使用することができる高度にカスタマイズ可能な手順である。創傷治癒プロジェクトを開始する前に、研究者は、特定の効果サイズの欠陥を検出するために必要な創傷の数を決定するために、パワー分析を実行する必要があります。個々のマウスまたは創傷を生物学的複製として使用すべきかどうかについての文献内に?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、長年にわたってこのプロトコルの最適化に貢献してきたダンヴァルト研究所のすべてのメンバーと、創傷分析のための連続断面の使用を促進する粘り強さが、その作成を可能にしたジーナ・シャッテマンに感謝しています。この研究は、NIH/NIAMSからマーティン・ダンヴァルト(AR067739)への資金提供によって支えられた。
Materials
| 100% ethanol | |||
| 70% ethanol | |||
| 80% ethanol | |||
| 95% ethanol | |||
| Alcohol Prep | NOVAPLUS | V9100 | 70% Isopropyl alcohol, sterile |
| Ammonium hydroxide | |||
| Biopsy pads | Cellpath | 22-222-012 | |
| Black plastic sheet | Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper | ||
| Brightfield microscope | With digital acquisition capabilities and a 4X objective | ||
| Cotton tipped applicators | |||
| Coverslips | 22 x 60 #1 | ||
| Dental wax sheets | |||
| Digital camera | Include a ruler for scale, if applicable | ||
| Dissection teasing needle (straight) | |||
| Embedding molds | 22 x 22 x 12 | ||
| Embedding rings | Simport Scientific Inc. | M460 | |
| Eosin Y | |||
| Glacial acetic acid | |||
| Hair clipper | |||
| Heating pad | Conair | Moist dry Heating Pad | |
| Hematoxylin | |||
| Microtome | |||
| Microtome blades | |||
| Paint brushes | |||
| Paraffin Type 6 | |||
| Paraformaldehyde | |||
| Permount | |||
| Phosphate buffer solution (PBS) | |||
| Povidone-iodine | Aplicare | 82-255 | |
| Processing cassette | Simport Scientific Inc. | M490-2 | |
| Razor blades | ASR | .009 Regular Duty | |
| Scalpel blades #10 | |||
| Scalpel handle | |||
| Sharp surgical scissors | sterile for surgery | ||
| Skin biopsy punches | Size as determined by researcher | ||
| Slide boxes | |||
| Slide warmers | |||
| Superfrosted microscope slides | Fisher Scientific | 22 037 246 | |
| Temperature control water bath | |||
| Tissue embedding station | Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate | ||
| Tissue processor | Minimum of a oven with a vacuum pump | ||
| Triple antibiotic opthalmic ointment | |||
| tweezers, curved tip | sterile for surgery | ||
| tweezers, tapered tip | sterile for surgery | ||
| WypAll X60 | Kimberly-Clark | 34865 |
References
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
- Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models. Wound Repair Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).
- Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine Models for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
- Crowe, M. J., Doetschman, T., Greenhalgh, D. G. Delayed wound healing in immunodeficient TGF-beta 1 knockout mice. Journal of Investigative Dermatology. 115 (1), 3-11 (2000).
- Pietramaggiori, G., et al. Improved cutaneous healing in diabetic mice exposed to healthy peripheral circulation. Journal of Investigative Dermatology. 129 (9), 2265-2274 (2009).
- Cold Spring Harbor. Paraformaldehyde in PBS. Cold Spring Harbor Protocols. 1 (1), (2006).
- Gerharz, M., et al. Morphometric analysis of murine skin wound healing: standardization of experimental procedures and impact of an advanced multitissue array technique. Wound Repair Regeneration. 15 (1), 105-112 (2007).
- Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair Regeneration. 14 (1), 81-90 (2006).
- Le, M., et al. Transforming growth factor beta 3 is required for proper excisional wound repair in vivo. PLoS One. 7 (10), 48040 (2012).
- Sato, T., Yamamoto, M., Shimosato, T., Klinman, D. M. Accelerated wound healing mediated by activation of Toll-like receptor 9. Wound Repair Regeneration. 18 (6), 586-593 (2010).
- Martin, P., Leibovich, S. J. Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).
- Shaw, T. J., Martin, P. Wound repair: a showcase for cell plasticity and migration. Current Opinion in Cell Biology. 42, 29-37 (2016).
- Hoffman, M., Monroe, D. M. Low intensity laser therapy speeds wound healing in hemophilia by enhancing platelet procoagulant activity. Wound Repair Regeneration. 20 (5), 770-777 (2012).
- Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
- Uchiyama, A., et al. SOX2 Epidermal Overexpression Promotes Cutaneous Wound Healing via Activation of EGFR/MEK/ERK Signaling Mediated by EGFR Ligands. Journal of Investigative Dermatology. 139 (8), 1809-1820 (2019).
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Rhea, L., et al. Interferon regulatory factor 6 is required for proper wound healing in vivo. Developmental Dynamics. 249 (4), 509-522 (2020).
