Modello di guarigione delle ferite escisionali murine e analisi istologica delle ferite morfometriche
Summary
Questo protocollo descrive come generare ferite escisionali bilaterali a pieno spessore nei topi e come monitorare, raccogliere e preparare successivamente le ferite per l’analisi morfometrica. È inclusa una descrizione approfondita di come utilizzare sezioni istologiche seriali per definire, quantificare e rilevare con precisione i difetti morfometrici.
Abstract
Il modello di ferita escisionale murina è stato ampiamente utilizzato per studiare ciascuna delle fasi sequenzialmente sovrapposte della guarigione delle ferite: infiammazione, proliferazione e rimodellamento. Le ferite murine hanno un letto di ferita istologicamente ben definito e facilmente riconoscibile su cui sono misurabili queste diverse fasi del processo di guarigione. All’interno del campo, è comune usare un “mezzo” arbitrariamente definito della ferita per analisi istologiche. Tuttavia, le ferite sono un’entità tridimensionale e spesso non istologicamente simmetriche, supportando la necessità di un metodo di quantificazione ben definito e robusto per rilevare difetti morfometrici con una piccola dimensione dell’effetto. In questo protocollo, descriviamo la procedura per la creazione di ferite adicisionali bilaterali a pieno spessore nei topi, nonché un’istruzione dettagliata su come misurare i parametri morfometrici utilizzando un programma di elaborazione delle immagini su sezioni seriali selezionate. Le misurazioni a due dimensioni della lunghezza della ferita, della lunghezza epidermica, dell’area epidermica e dell’area della ferita sono utilizzate in combinazione con la distanza nota tra le sezioni per estrapolare l’area epidermica a tre dimensioni che copre la ferita, l’area complessiva della ferita, il volume epidermico e il volume della ferita. Sebbene questa dettagliata analisi istologica sia più dispendiosa in termini di tempo e risorse rispetto alle analisi convenzionali, il suo rigore aumenta la probabilità di rilevare nuovi fenotipi in un processo di guarigione delle ferite intrinsecamente complesso.
Introduction
La guarigione cutanea delle ferite è un processo biologico complesso con fasi di sovrapposizione sequenziale. Richiede la coordinazione di processi cellulari e molecolari che sono regolati in modo temporale e spaziale al fine di ripristinare la funzione barriera dell’epitelio danneggiato. Nella prima fase, infiammazione, neutrofili e macrofagi migrano nella ferita, mobilitando difese locali e sistemiche1. Seguire e sovrapporre la fase infiammatoria è la fase di proliferazione. I fibroblasti iniziano rapidamente a prolifere e migrare nel tessuto di granulazione. I cheratinociti lontano dal bordo d’attacco proliferano direzionale verso la ferita mentre i cheratinociti differenziati nel bordo anteriore migrano per er epitelializzare laferita 2. Infine, inizia la fase di rimodellamento e maturazione, durante la quale i fibroblasti nel tessuto di granulazione iniziano a sintetizzare e depositare collagene. Il rimodellamento e l’organizzazione della nuova matrice possono durare fino a 1 anno dopo l’infortunio3. A causa della complessità degli eventi sovrapposti che coinvolgono il cross-talk tra più tipi di cellule, e nonostante anni di ricerca, molti dei meccanismi cellulari e molecolari alla base della guarigione delle ferite rimangono poco compresi.
Il modello di topo è il modello di mammifero predominante per lo studio dei meccanismi di guarigione delle ferite a causa della loro facilità d’uso, costo relativamente basso e manipolabilità genetica1,4,5. Sebbene diversi tipi di ferite siano stati descritti nel modello murino, il più comune è una ferita adicisionale (pugno bilaterale o biopsia a pugno diretto), seguita da modelli di ferita incisiva4. Il modello di ferita adicizionale ha un netto vantaggio rispetto al modello incisivo in quanto genera intrinsecamente tessuto di controllo che non ha subito il processo di guarigione. Il tessuto di biopsia del punzone che viene asportato come parte del protocollo chirurgico può essere elaborato allo stesso modo del tessuto ferito e utilizzato per stabilire le condizioni omeostatiche per un criterio desiderato. Il tessuto di controllo delle accise può anche essere utile se si valutano gli effetti di un pretrattamento cutaneo o si conferma un’alterazione genica riuscita al momento dellalesione 4.
I parametri di guarigione possono essere valutati con molte tecniche diverse, tra cui planimetria o istologia. Tuttavia, la planimetria può solo valutare le caratteristiche visibili della ferita, e a causa della presenza di una crosta, spesso non è correlata a misurazioni di guarigione che vengono visualizzate dall’istologia, rendendo così l’istologia il “gold standard” dell’analisi4. Nonostante l’analisi istologica sia il gold standard, viene spesso eseguita su un sottoinsieme arbitrario della ferita6,7. Ad esempio, tagliare la ferita a “metà” prima di incorporare e sessare la ferita è attualmente una pratica comune per ridurre il tempo e le risorse spesi per sezionamento dei materiali e analisi dei dati. Il metodo di analisi morfometrica descritto in questo protocollo è stato sviluppato per comprendere l’intero tessuto della ferita, per riflettere accuratamente le caratteristiche morfologiche della ferita e per aumentare la probabilità di rilevare difetti di guarigione delle ferite con una piccola dimensione dell’effetto. In questo protocollo, dettagliamo un metodo chirurgico per generare la ferita murina più comunemente studiata, la ferita incisiva bilaterale a pieno spessore, nonché un metodo dettagliato e rigoroso per l’analisi istologica che viene usato raramente sul campo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il modello bilaterale di ferita accisa è una procedura altamente personalizzabile che può essere utilizzata per studiare molti aspetti diversi della guarigione delle ferite. Prima di iniziare un progetto di guarigione delle ferite, gli investigatori devono eseguire un’analisi del potere per determinare il numero di ferite necessarie per rilevare un difetto di una particolare dimensione dell’effetto. Esistono incongruenze all’interno della letteratura sul fatto che singoli topi o ferite debbano essere usati come replich…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati a tutti i membri del Dunnwald Lab che hanno contribuito all’ottimizzazione di questo protocollo nel corso degli anni, e a Gina Schatteman la cui persistenza nel promuovere l’uso del sezionale seriale per l’analisi delle ferite ne ha reso possibile la creazione. Questo lavoro è stato supportato da finanziamenti da NIH /NIAMS a Martine Dunnwald (AR067739).
Materials
| 100% ethanol | |||
| 70% ethanol | |||
| 80% ethanol | |||
| 95% ethanol | |||
| Alcohol Prep | NOVAPLUS | V9100 | 70% Isopropyl alcohol, sterile |
| Ammonium hydroxide | |||
| Biopsy pads | Cellpath | 22-222-012 | |
| Black plastic sheet | Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper | ||
| Brightfield microscope | With digital acquisition capabilities and a 4X objective | ||
| Cotton tipped applicators | |||
| Coverslips | 22 x 60 #1 | ||
| Dental wax sheets | |||
| Digital camera | Include a ruler for scale, if applicable | ||
| Dissection teasing needle (straight) | |||
| Embedding molds | 22 x 22 x 12 | ||
| Embedding rings | Simport Scientific Inc. | M460 | |
| Eosin Y | |||
| Glacial acetic acid | |||
| Hair clipper | |||
| Heating pad | Conair | Moist dry Heating Pad | |
| Hematoxylin | |||
| Microtome | |||
| Microtome blades | |||
| Paint brushes | |||
| Paraffin Type 6 | |||
| Paraformaldehyde | |||
| Permount | |||
| Phosphate buffer solution (PBS) | |||
| Povidone-iodine | Aplicare | 82-255 | |
| Processing cassette | Simport Scientific Inc. | M490-2 | |
| Razor blades | ASR | .009 Regular Duty | |
| Scalpel blades #10 | |||
| Scalpel handle | |||
| Sharp surgical scissors | sterile for surgery | ||
| Skin biopsy punches | Size as determined by researcher | ||
| Slide boxes | |||
| Slide warmers | |||
| Superfrosted microscope slides | Fisher Scientific | 22 037 246 | |
| Temperature control water bath | |||
| Tissue embedding station | Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate | ||
| Tissue processor | Minimum of a oven with a vacuum pump | ||
| Triple antibiotic opthalmic ointment | |||
| tweezers, curved tip | sterile for surgery | ||
| tweezers, tapered tip | sterile for surgery | ||
| WypAll X60 | Kimberly-Clark | 34865 |
References
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