Modelo de cicatrización de heridas excisionales de Murine y análisis de heridas morfométricas histológicas
Summary
Este protocolo describe cómo generar heridas de escisión bilaterales de espesor completo en ratones y cómo monitorear, cosechar y preparar las heridas para el análisis morfométrico. Se incluye una descripción detallada de cómo utilizar secciones histológicas seriales para definir, cuantificar y detectar defectos morfométricos con precisión.
Abstract
El modelo de heridas escisionales murinas se ha utilizado ampliamente para estudiar cada una de las fases secuencialmente superpuestas de la cicatrización de heridas: inflamación, proliferación y remodelación. Las heridas murinas tienen un lecho de heridas histológicamente bien definido y fácilmente reconocible sobre el cual estas diferentes fases del proceso de curación son medibles. Dentro del campo, es común utilizar un “medio” definido arbitrariamente de la herida para análisis histológicos. Sin embargo, las heridas son una entidad tridimensional y a menudo no es histológicamente simétricas, lo que apoya la necesidad de un método de cuantificación bien definido y robusto para detectar defectos morfométricos con un tamaño de efecto pequeño. En este protocolo, describimos el procedimiento para crear heridas de escisión bilaterales de espesor completo en ratones, así como una instrucción detallada sobre cómo medir parámetros morfométricos utilizando un programa de procesamiento de imágenes en secciones seriales selectas. Las mediciones de dos dimensiones de la longitud de la herida, la longitud epidérmica, el área epidérmica y el área de la herida se utilizan en combinación con la distancia conocida entre las secciones para extrapolar el área epidérmica de tres dimensiones que cubre la herida, el área general de la herida, el volumen epidérmico y el volumen de la herida. Aunque este análisis histológico detallado consume más tiempo y recursos que los análisis convencionales, su rigor aumenta la probabilidad de detectar nuevos fenotipos en un proceso de cicatrización de heridas inherentemente complejo.
Introduction
La cicatrización de heridas cutáneas es un proceso biológico complejo con fases que se superponen secuencialmente. Requiere la coordinación de procesos celulares y moleculares que están regulados temporal y espacialmente para restaurar la función de barrera del epitelio dañado. En la primera fase, la inflamación, los neutrófilos y los macrófagos migran a la herida, movilizando las defensas locales y sistémicas1. Seguir y superponer la fase inflamatoria es la etapa de proliferación. Los fibroblastos comienzan a proliferar y migrar rápidamente al tejido de granulación. Los queratinocitos alejados del borde delantero proliferan direccionalmente hacia la herida a medida que los queratinocitos diferenciados en el borde delantero migran para volver a epitelizar la herida2. Finalmente, comienza la fase de remodelación y maduración, durante la cual los fibroblastos en el tejido de granulación comienzan a sintetizar y depositar colágeno. La remodelación y organización de la nueva matriz puede durar hasta 1 año después de la lesión3. Debido a la complejidad de los eventos superpuestos que implican conversaciones cruzadas entre múltiples tipos de células, y a pesar de años de investigación, muchos de los mecanismos celulares y moleculares subyacentes a la cicatrización de heridas siguen siendo poco entendidos.
El modelo de ratón es el modelo predominante de mamíferos para investigar los mecanismos de cicatrización de heridas debido a su facilidad de uso, relativamente bajo costo y manipulabilidad genética1,4,5. Aunque se han descrito diferentes tipos de heridas en el modelo murino, la más común es una herida escisional (ya sea perforación bilateral o biopsia por punción directa), seguida de los modelos de heridas incisionales4. El modelo de herida escisión tiene una clara ventaja sobre el modelo de incisión, ya que genera intrínsecamente tejido de control que no ha sido sometido al proceso de curación. El tejido de biopsia por punción que se extirpa como parte del protocolo quirúrgico se puede procesar de la misma manera que el tejido herido y se utiliza para establecer las condiciones homeostáticas para un criterio deseado. El tejido de control extirpado también puede ser útil si se evalúan los efectos de un pretratamiento cutáneo o se confirma una alteración genética exitosa en el momento de la lesión4.
Los parámetros de curación se pueden evaluar mediante muchas técnicas diferentes, como la planimetría o la histología. Sin embargo, la planimetría sólo puede evaluar las características visibles de la herida, y debido a la presencia de una costra, a menudo no se correlaciona con las mediciones de curación que se visualizan por histología, haciendo de la histología el “estándar de oro” del análisis4. A pesar de que el análisis histológico es el estándar de oro, se realiza con mayor frecuencia en un subconjunto arbitrario de la herida6,7. Por ejemplo, cortar la herida en “la mitad” antes de incrustar y secciones de la herida es actualmente una práctica común para reducir el tiempo y los recursos invertidos en la sección de materiales y análisis de datos. El método de análisis morfométrico descrito en este protocolo fue desarrollado para abarcar todo el tejido de la herida, para reflejar con precisión las características morfológicas de la herida, y para aumentar la probabilidad de detectar defectos de cicatrización de heridas con un tamaño de efecto pequeño. En este protocolo, detallamos un método quirúrgico para generar la herida murina más comúnmente estudiada, la herida excisional bilateral de espesor completo, así como un método detallado y riguroso para el análisis histológico tal se utiliza raramente en el campo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El modelo bilateral de heridas por escisión es un procedimiento altamente personalizable que se puede utilizar para estudiar muchos aspectos diferentes de la cicatrización de heridas. Antes de comenzar un proyecto de cicatrización de heridas, los investigadores deben realizar un análisis de potencia para determinar el número de heridas necesarias para detectar un defecto de un tamaño de efecto particular. Existen incoherencias en la literatura sobre si los ratones individuales o las heridas deben utilizarse como r?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a todos los miembros del Laboratorio Dunnwald que han contribuido a la optimización de este protocolo a lo largo de los años, y a Gina Schatteman cuya persistencia en la promoción del uso de la sección en serie para el análisis de heridas hizo posible su creación. Este trabajo fue apoyado por la financiación de NIH/NIAMS a Martine Dunnwald (AR067739).
Materials
| 100% ethanol | |||
| 70% ethanol | |||
| 80% ethanol | |||
| 95% ethanol | |||
| Alcohol Prep | NOVAPLUS | V9100 | 70% Isopropyl alcohol, sterile |
| Ammonium hydroxide | |||
| Biopsy pads | Cellpath | 22-222-012 | |
| Black plastic sheet | Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper | ||
| Brightfield microscope | With digital acquisition capabilities and a 4X objective | ||
| Cotton tipped applicators | |||
| Coverslips | 22 x 60 #1 | ||
| Dental wax sheets | |||
| Digital camera | Include a ruler for scale, if applicable | ||
| Dissection teasing needle (straight) | |||
| Embedding molds | 22 x 22 x 12 | ||
| Embedding rings | Simport Scientific Inc. | M460 | |
| Eosin Y | |||
| Glacial acetic acid | |||
| Hair clipper | |||
| Heating pad | Conair | Moist dry Heating Pad | |
| Hematoxylin | |||
| Microtome | |||
| Microtome blades | |||
| Paint brushes | |||
| Paraffin Type 6 | |||
| Paraformaldehyde | |||
| Permount | |||
| Phosphate buffer solution (PBS) | |||
| Povidone-iodine | Aplicare | 82-255 | |
| Processing cassette | Simport Scientific Inc. | M490-2 | |
| Razor blades | ASR | .009 Regular Duty | |
| Scalpel blades #10 | |||
| Scalpel handle | |||
| Sharp surgical scissors | sterile for surgery | ||
| Skin biopsy punches | Size as determined by researcher | ||
| Slide boxes | |||
| Slide warmers | |||
| Superfrosted microscope slides | Fisher Scientific | 22 037 246 | |
| Temperature control water bath | |||
| Tissue embedding station | Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate | ||
| Tissue processor | Minimum of a oven with a vacuum pump | ||
| Triple antibiotic opthalmic ointment | |||
| tweezers, curved tip | sterile for surgery | ||
| tweezers, tapered tip | sterile for surgery | ||
| WypAll X60 | Kimberly-Clark | 34865 |
References
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