Murine Excisional Wound Healing Model и гистологический морфометрический анализ ран
Summary
В этом протоколе описывается, как генерировать двусторонние, полно толщины эксцисионных ран у мышей и как впоследствии контролировать, собирать урожай и готовить раны к морфометрическому анализу. Включено подробное описание того, как использовать серийные гистологические разделы для определения, точной количественной оценки и обнаружения морфометрических дефектов.
Abstract
Murine excisional рана модель была широко использована для изучения каждого из последовательно перекрывающихся фаз заживления ран: воспаление, пролиферацию и ремоделирование. Мурин раны имеют гистологологически четко определенные и легко узнаваемые раны кровать, над которой эти различные фазы процесса заживления поддаются измерению. В полевых условиях для гистологических анализов обычно используется произвольно определенная «середина» раны. Однако раны являются трехмерной сущностью и зачастую не являются гисто логически симметричными, что поддерживает необходимость в четко определенном и надежном методе количественной оценки для обнаружения морфометрических дефектов с небольшим размером эффекта. В этом протоколе мы описываем процедуру создания двусторонних, полно толщины эксцизированных ран у мышей, а также подробную инструкцию о том, как измерить морфометрические параметры с помощью программы обработки изображений на отдельных серийных разделах. Двухмерные измерения длины раны, эпидермальной длины, эпидермальной области и области раны используются в сочетании с известным расстоянием между секциями для экстраполяции трехмерной эпидермальной области, покрывающей рану, общую область раны, эпидермальный объем и объем раны. Хотя этот подробный гистологический анализ занимает больше времени и ресурсов, чем обычные анализы, его строгость повышает вероятность обнаружения новых фенотипов в изначально сложном процессе заживления ран.
Introduction
Заживление к cutaneous раны сложный биологический процесс с последовательно перекрывая участками. Она требует координации клеточных и молекулярных процессов, которые временно и пространственно регулируются для восстановления барьерной функции поврежденного эпителия. На первой фазе воспаление, нейтрофилов и макрофаги мигрируют в рану, мобилизуя местную и системнуюзащиту 1. После и перекрытия воспалительной фазы является стадия распространения. Фибробласты начинают быстро размножаться и мигрировать в гранулированную ткань. Кератиноциты от ведущего края направленно размножаются к ране, как дифференцированные кератиноциты в переднем крае мигрируют, чтобы повторно эпителиализироватьрану 2. Наконец, начинается фаза ремоделирования и созревания, во время которой фибробласты в гранулированной ткани начинают синтезировать и от депозитать коллаген. Реконструкция и организация новой матрицы может длиться до 1 года после травмы3. Из-за сложности перекрывающихся событий, связанных с перекрестным разговором между несколькими типами клеток, и, несмотря на годы исследований, многие клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе заживления ран, остаются плохо понятыми.
Модель мыши является преобладающей моделью млекопитающих для исследования механизмов заживления ран из-за их простоты использования, относительно низкой стоимости игенетической манипулябельности 1,4,5. Хотя различные типы ран были описаны в модели мурина, наиболее распространенным является excisional раны (либо двусторонний удар или прямой удар биопсии), а затем разрезные моделираны 4. Эксцисионная модель раны имеет явное преимущество перед разрезной моделью, поскольку она по своей сути генерирует контрольную ткань, которая не прошла процесс заживления. Пунш биопсии ткани, которая вырезана в рамках хирургического протокола могут быть обработаны таким же образом, как раненые ткани и используется для создания гомеостатической условия для желаемого критерия. Акцизная контрольная ткань также может быть полезна при оценке последствий предлечения кожи или подтверждении успешного изменения гена во время травмы4.
Параметры исцеления могут быть оценены по различным методикам, включая планиметрию или гистологию. Тем не менее, планиметрия может только оценить видимые характеристики раны, и из-за наличия парши, часто не коррелирует с измерениями исцеления, которые визуализированы гистологии, тем самым делая гистологию “золотым стандартом” анализа4. Несмотря на гистологический анализ, является золотым стандартом, чаще всего он выполняется на произвольном подмножествераны 6,7. Например, сокращение раны на “половину” до встраивания и секции раны в настоящее время является обычной практикой для сокращения времени и ресурсов, затраченных на секционные материалы и анализ данных. Метод морфометрического анализа, описанный в этом протоколе, был разработан, чтобы охватить всю раневую ткань, точно отражать морфологические характеристики раны, а также увеличить вероятность обнаружения дефектов заживления ран с небольшим размером эффекта. В этом протоколе мы подробно хирургического метода для генерации наиболее часто изученных мурин раны, двусторонней полной толщины эксцизной раны, а также подробный и строгий метод гистологического анализа такие редко используется в полевых условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Двусторонняя эксциобразная модель раны является весьма настраиваемой процедурой, которая может быть использована для изучения многих различных аспектов заживления ран. Перед началом проекта заживления ран, исследователи должны выполнить анализ мощности, чтобы определить количеств?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признательны всем сотрудникам лаборатории Даннвальда, которые внесли свой вклад в оптимизацию этого протокола на протяжении многих лет, и Джине Шаттеман, чья настойчивость в продвижении использования серийного сечения для анализа ран сделала его создание возможным. Эта работа была поддержана финансированием от NIH/NIAMS Мартине Даннвальд (AR067739).
Materials
| 100% ethanol | |||
| 70% ethanol | |||
| 80% ethanol | |||
| 95% ethanol | |||
| Alcohol Prep | NOVAPLUS | V9100 | 70% Isopropyl alcohol, sterile |
| Ammonium hydroxide | |||
| Biopsy pads | Cellpath | 22-222-012 | |
| Black plastic sheet | Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper | ||
| Brightfield microscope | With digital acquisition capabilities and a 4X objective | ||
| Cotton tipped applicators | |||
| Coverslips | 22 x 60 #1 | ||
| Dental wax sheets | |||
| Digital camera | Include a ruler for scale, if applicable | ||
| Dissection teasing needle (straight) | |||
| Embedding molds | 22 x 22 x 12 | ||
| Embedding rings | Simport Scientific Inc. | M460 | |
| Eosin Y | |||
| Glacial acetic acid | |||
| Hair clipper | |||
| Heating pad | Conair | Moist dry Heating Pad | |
| Hematoxylin | |||
| Microtome | |||
| Microtome blades | |||
| Paint brushes | |||
| Paraffin Type 6 | |||
| Paraformaldehyde | |||
| Permount | |||
| Phosphate buffer solution (PBS) | |||
| Povidone-iodine | Aplicare | 82-255 | |
| Processing cassette | Simport Scientific Inc. | M490-2 | |
| Razor blades | ASR | .009 Regular Duty | |
| Scalpel blades #10 | |||
| Scalpel handle | |||
| Sharp surgical scissors | sterile for surgery | ||
| Skin biopsy punches | Size as determined by researcher | ||
| Slide boxes | |||
| Slide warmers | |||
| Superfrosted microscope slides | Fisher Scientific | 22 037 246 | |
| Temperature control water bath | |||
| Tissue embedding station | Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate | ||
| Tissue processor | Minimum of a oven with a vacuum pump | ||
| Triple antibiotic opthalmic ointment | |||
| tweezers, curved tip | sterile for surgery | ||
| tweezers, tapered tip | sterile for surgery | ||
| WypAll X60 | Kimberly-Clark | 34865 |
References
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
- Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models. Wound Repair Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).
- Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine Models for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
- Crowe, M. J., Doetschman, T., Greenhalgh, D. G. Delayed wound healing in immunodeficient TGF-beta 1 knockout mice. Journal of Investigative Dermatology. 115 (1), 3-11 (2000).
- Pietramaggiori, G., et al. Improved cutaneous healing in diabetic mice exposed to healthy peripheral circulation. Journal of Investigative Dermatology. 129 (9), 2265-2274 (2009).
- Cold Spring Harbor. Paraformaldehyde in PBS. Cold Spring Harbor Protocols. 1 (1), (2006).
- Gerharz, M., et al. Morphometric analysis of murine skin wound healing: standardization of experimental procedures and impact of an advanced multitissue array technique. Wound Repair Regeneration. 15 (1), 105-112 (2007).
- Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair Regeneration. 14 (1), 81-90 (2006).
- Le, M., et al. Transforming growth factor beta 3 is required for proper excisional wound repair in vivo. PLoS One. 7 (10), 48040 (2012).
- Sato, T., Yamamoto, M., Shimosato, T., Klinman, D. M. Accelerated wound healing mediated by activation of Toll-like receptor 9. Wound Repair Regeneration. 18 (6), 586-593 (2010).
- Martin, P., Leibovich, S. J. Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).
- Shaw, T. J., Martin, P. Wound repair: a showcase for cell plasticity and migration. Current Opinion in Cell Biology. 42, 29-37 (2016).
- Hoffman, M., Monroe, D. M. Low intensity laser therapy speeds wound healing in hemophilia by enhancing platelet procoagulant activity. Wound Repair Regeneration. 20 (5), 770-777 (2012).
- Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
- Uchiyama, A., et al. SOX2 Epidermal Overexpression Promotes Cutaneous Wound Healing via Activation of EGFR/MEK/ERK Signaling Mediated by EGFR Ligands. Journal of Investigative Dermatology. 139 (8), 1809-1820 (2019).
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Rhea, L., et al. Interferon regulatory factor 6 is required for proper wound healing in vivo. Developmental Dynamics. 249 (4), 509-522 (2020).
