뮤린 흥분 상처 치유 모델 및 조직학적 형태화 상처 분석
Summary
이 프로토콜은 마우스에서 양자, 전체 두께 절제적 상처를 생성하는 방법과 이후에 형태 분석을 위해 상처를 모니터링, 수확 및 준비하는 방법을 설명합니다. 여기에는 직렬 조직학적 섹션을 사용하여 형태학적 결함을 정의하고 정확하게 정량화하고 감지하는 방법에 대한 심층적인 설명이 포함되어 있습니다.
Abstract
뮤린 절제 상처 모델은 염증, 증식 및 리모델링 : 상처 치유의 순차적으로 겹치는 각 단계를 연구하기 위해 광범위하게 사용되었습니다. 뮤린 상처는 치유 과정의 이러한 다른 단계가 측정 할 수있는 조직학적으로 잘 정의되고 쉽게 인식 할 수있는 상처 침대를 가지고 있습니다. 필드 내에서 조직학적 분석을 위해 임의로 정의된 상처 “중간”을 사용하는 것이 일반적입니다. 그러나 상처는 3차원 실체이며 종종 조직학적으로 대칭적이지 않으며, 작은 효과 크기로 형태학적 결함을 검출하기 위해 잘 정의되고 견고한 정량화 방법의 필요성을 뒷받침한다. 이 프로토콜에서는 마우스에서 양자, 전체 두께 절제적 상처를 만드는 절차뿐만 아니라 일부 직렬 섹션에서 이미지 처리 프로그램을 사용하여 형태 매개 변수를 측정하는 방법에 대한 자세한 지침을 설명합니다. 상처 길이, 표피 길이, 표피 영역 및 상처 영역의 2차원 측정은 상처, 전체 상처 영역, 표피 부피 및 상처 부피를 포함하는 3 차원 표피 영역을 추정하기 위해 섹션 사이의 알려진 거리와 함께 사용됩니다. 이 상세한 조직학적 분석은 기존의 분석보다 시간과 자원이 더 많이 소비되지만, 그 엄격함은 본질적으로 복잡한 상처 치유 과정에서 새로운 표현형을 검출할 가능성을 증가시킵니다.
Introduction
피부 상처 치유는 순차적으로 겹치는 단계를 가진 복잡한 생물학적 과정입니다. 손상된 상피의 장벽 기능을 복원하기 위해 일시적이고 공간적으로 조절되는 세포 및 분자 공정의 조정이 필요합니다. 첫 번째 단계에서염증, 호중구 및 대식세포는 상처로 이동하여 국소 및 전신 방어1을동원합니다. 염증 단계를 따르고 겹치는 것은 증식 단계입니다. 섬유아세포는 급속히 확산되고 과립 조직으로 이동하기 시작합니다. 선두 가장자리에서 멀리 각질세포는 앞가장자리에서 분화된 각질 세포가 상처2를다시 상형화하기 위해 이동함에 따라 상처쪽으로 방향을 내다보며 증식한다. 마지막으로, 리모델링 및 성숙 단계가 시작되며, 그 동안 과립 조직의 섬유아세포는 콜라겐을 합성하고 퇴적시키기 시작합니다. 새 행렬의 리모델링 및 조직은 부상3다음에 최대 1년까지 지속될 수 있습니다. 때문에 다중 세포 모형 사이 교차 이야기와 관련시키는 중복한 사건의 복잡성 때문에, 그리고 수년간의 연구에도 불구하고, 상처 치유의 근본적인 세포 및 분자 기계장치의 많은 것은 제대로 이해되지 않습니다.
마우스 모델은 사용편의성, 상대적으로 저렴한 비용 및 유전적 매니풀성1,4,5로인한 상처 치유 메커니즘을 조사하기 위한 주요 포유류 모델이다. 다른 유형의 상처가 뮤린 모델에서 설명되었지만, 가장 흔한 상처는 절제적 상처 (양측 펀치 또는 직접 펀치 생검)이며 절개 상처 모델4가뒤따릅니다. 절제상처 모델은 본질적으로 치유 과정을 거치지 않은 대조군 조직을 생성하기 때문에 절개 모델에 비해 뚜렷한 이점이 있다. 외과 프로토콜의 일부로 절제되는 펀치 생검 조직은 상처입은 조직과 동일한 방식으로 처리될 수 있으며 원하는 기준을 위한 동종 성 조건을 확립하는 데 사용될 수 있다. 절제된 대조군 조직은 또한 피부 전처리의 효과를 평가하거나 부상 시 성공적인 유전자 변경을 확인하는 경우에 유용할 수 있다4.
치유 매개 변수는 평면도 또는 히스토로지를 포함한 다양한 기술에 의해 평가될 수 있다. 그러나, 평면도는 상처의 가시적 특성만을 평가할 수 있으며, 딱지의 존재로 인해, 종종 히스토로지에 의해 시각화되는 치유의 측정과 상관관계가 없기 때문에, 따라서 히스토로지분석4의“금본위제”를 만든다. 조직학적 분석이 금본위제임에도 불구하고, 상처6,7의임의하위집합에서 가장 자주 수행됩니다. 예를 들어, 상처를 포함시키고 절단하기 전에 상처를 “절반”으로 절단하는 것은 현재 재료 및 데이터 분석에 소요되는 시간과 자원을 줄이는 일반적인 관행입니다. 본 프로토콜에 기재된 형태 분석 방법은 전체 상처 조직을 포괄하고, 상처의 형태학적 특성을 정확하게 반영하고, 작은 효과 크기로 상처 치유 결함을 검출할 가능성을 높이기 위해 개발되었다. 본 프로토콜에서, 우리는 가장 일반적으로 연구된 뮤린 상처, 양측 전체 두께 절제적 상처를 생성하기 위한 수술 방법뿐만 아니라, 조직학적 분석을 위한 상세하고 엄격한 방법을 현장에서 거의 사용되지 않습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
양측 절제 상처 모델은 상처 치유의 많은 다른 측면을 연구하는 데 사용할 수있는 매우 사용자 정의 절차입니다. 상처 치유 프로젝트를 시작하기 전에 조사관은 특정 효과 크기의 결함을 감지하는 데 필요한 상처 수를 결정하기 위해 전력 분석을 수행해야합니다. 개별 마우스 또는 상처가 생물학적 복제로 사용되어야 하는지에 대한 문헌 내에 불일치가 존재하지만, 최근 연구에 따르면 단일 동물<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 수년에 걸쳐이 프로토콜의 최적화에 기여 한 던발트 연구소의 모든 구성원과 상처 분석을위한 직렬 단면의 사용을 촉진하는 지속성 지나 샤테만에게 감사드립니다. 이 작품은 NIH /NIAMS에서 마틴 던발트 (AR067739)에 대한 자금 지원을 받았습니다.
Materials
| 100% ethanol | |||
| 70% ethanol | |||
| 80% ethanol | |||
| 95% ethanol | |||
| Alcohol Prep | NOVAPLUS | V9100 | 70% Isopropyl alcohol, sterile |
| Ammonium hydroxide | |||
| Biopsy pads | Cellpath | 22-222-012 | |
| Black plastic sheet | Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper | ||
| Brightfield microscope | With digital acquisition capabilities and a 4X objective | ||
| Cotton tipped applicators | |||
| Coverslips | 22 x 60 #1 | ||
| Dental wax sheets | |||
| Digital camera | Include a ruler for scale, if applicable | ||
| Dissection teasing needle (straight) | |||
| Embedding molds | 22 x 22 x 12 | ||
| Embedding rings | Simport Scientific Inc. | M460 | |
| Eosin Y | |||
| Glacial acetic acid | |||
| Hair clipper | |||
| Heating pad | Conair | Moist dry Heating Pad | |
| Hematoxylin | |||
| Microtome | |||
| Microtome blades | |||
| Paint brushes | |||
| Paraffin Type 6 | |||
| Paraformaldehyde | |||
| Permount | |||
| Phosphate buffer solution (PBS) | |||
| Povidone-iodine | Aplicare | 82-255 | |
| Processing cassette | Simport Scientific Inc. | M490-2 | |
| Razor blades | ASR | .009 Regular Duty | |
| Scalpel blades #10 | |||
| Scalpel handle | |||
| Sharp surgical scissors | sterile for surgery | ||
| Skin biopsy punches | Size as determined by researcher | ||
| Slide boxes | |||
| Slide warmers | |||
| Superfrosted microscope slides | Fisher Scientific | 22 037 246 | |
| Temperature control water bath | |||
| Tissue embedding station | Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate | ||
| Tissue processor | Minimum of a oven with a vacuum pump | ||
| Triple antibiotic opthalmic ointment | |||
| tweezers, curved tip | sterile for surgery | ||
| tweezers, tapered tip | sterile for surgery | ||
| WypAll X60 | Kimberly-Clark | 34865 |
References
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