Murine Excisional sårläkning Modell och histologiska morfinmetriska såranalys
Summary
Detta protokoll beskriver hur du genererar bilaterala excisionella sår med full tjocklek hos möss och hur man därefter övervakar, skördar och förbereder såren för morfometrisk analys. Inkluderat är en ingående beskrivning av hur man använder seriella histologiska avsnitt för att definiera, exakt kvantifiera och upptäcka morfometriska defekter.
Abstract
Den murine excisional sårmodellen har använts i stor utsträckning för att studera var och en av de sekventiellt överlappande faserna av sårläkning: inflammation, proliferation och ombyggnad. Murine sår har en histologiskt väldefinierad och lätt igenkännlig sårbädd över vilka dessa olika faser av läkningsprocessen är mätbara. Inom området är det vanligt att använda ett godtyckligt definierat “mitten” av såret för histologiska analyser. Sår är dock en tredimensionell enhet och ofta inte histologiskt symmetriska, stödja behovet av en väldefinierad och robust metod för kvantifiering att upptäcka morphometric defekter med en liten effekt storlek. I detta protokoll beskriver vi proceduren för att skapa bilaterala, full-tjocklek excisional sår i möss samt en detaljerad instruktion om hur man mäter morfometer parametrar med hjälp av ett bildbehandlingsprogram på välj seriella avsnitt. De tvådimensionsmått av sårlängd, epidermal längd, epidermalt område och sårområde används i kombination med det kända avståndet mellan sektioner för att extrapolera det epidermala området med tre dimensioner som täcker såret, den totala sårytan, den epidermala volymen och sårvolymen. Även om denna detaljerade histologiska analys är mer tid och resurs konsumerar än konventionella analyser, ökar dess rigor sannolikheten för att upptäcka nya fenotyper i en inneboende komplexa sårläkningsprocessen.
Introduction
Testning sårläkning är en komplex biologisk process med sekventiellt överlappande faser. Det kräver samordning av cellulära och molekylära processer som är tidsmässigt och rumsligt reglerade för att återställa barriärfunktionen hos det skadade epitelet. I den första fasen, inflammation, neutrofiler och makrofager migrera in i såret, mobilisera lokala och systemiska försvar1. Efter och överlappande den inflammatoriska fasen är spridningsstadiet. Fibroblaster börjar snabbt proliferera och migrera in i granulationsvävnaden. Keratinocyter bort från framkanten riktad föröka sig mot såret som differentierade keratinocyter i framkanten migrera till åter epithelialisera såret2. Slutligen börjar ombyggnads- och mognadsfasen, under vilken fibroblaster i granulationsvävnaden börjar syntetisera och deponera kollagen. Ombyggnad och organisation av den nya matrisen kan pågå upp till 1 år efter skada3. På grund av komplexiteten i överlappande händelser som involverar cross-talk mellan flera celltyper, och trots år av forskning, många av de cellulära och molekylära mekanismer bakom sårläkning förbli dåligt förstådd.
Musmodellen är den dominerande däggdjursmodellen för att undersöka mekanismer för sårläkning på grund av deras användarvänlighet, relativt låg kostnad och genetisk manipulabilitet1,4,5. Även om olika typer av sår har beskrivits i murine modellen, den vanligaste är en excisional sår (antingen bilaterala punch eller direkt punch biopsi), följt av incisional sår modeller4. Excisional sår modellen har en klar fördel jämfört med den incisional modellen som det i sig genererar kontroll vävnad som inte har genomgått läkningsprocessen. Den hålslagsbiopsivävnad som strukits som en del av det kirurgiska protokollet kan bearbetas på samma sätt som den sårade vävnaden och användas för att fastställa de homeostatiska villkoren för ett önskat kriterium. Struken kontrollvävnad kan också vara användbar om man bedömer effekterna av en hudförbehandling eller bekräftar en lyckad genförändelse vid tidpunkten för skadan4.
Läkningsparametrar kan bedömas av många olika tekniker, inklusive planimetry eller histologi. Dock kan planimetry endast utvärdera synliga egenskaper av såret, och på grund av närvaron av en sårskorpa, ofta inte korrelerar till mätningar av läkning som visualiseras av histologi, därigenom gör histologi “guldmyntfoten” av analys4. Trots histologisk analys är den gyllene standarden, är det oftast utförs på en godtycklig delmängd av såret6,7. Till exempel, skära såret i “halv” före inbäddning och avsnittning såret är för närvarande vanligt att minska den tid och resurser som spenderas på sektionering material och dataanalys. Metoden för morfometer analys som beskrivs i detta protokoll utvecklades för att omfatta hela sårvävnaden, att korrekt återspegla morfologiska egenskaper såret, och att öka sannolikheten för att upptäcka sårläkning defekter med en liten effekt storlek. I detta protokoll, vi detalj en kirurgisk metod för att generera de vanligaste studerade murine såret, den bilaterala full-tjocklek excisional sår, samt en detaljerad och rigorös metod för histologiska analys sådan används sällan i fältet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den bilaterala excisional sår modellen är en mycket anpassningsbar förfarande som kan användas för att studera många olika aspekter av sårläkning. Innan du påbörjar ett sårläkningsprojekt bör utredarna utföra en effektanalys för att fastställa antalet sår som behövs för att upptäcka en defekt av en viss effektstorlek. Inkonsekvenser finns inom litteraturen om huruvida enskilda möss eller sår bör användas som biologiska replikat, men en färsk studie visade att det inte finns någon signifikant kor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma mot alla medlemmar i Dunnwald Lab som har bidragit till optimering av detta protokoll genom åren, och till Gina Schatteman vars uthållighet i att främja användningen av seriell snittning för såranalys gjorde dess skapelse möjlig. Detta arbete stöddes av finansiering från NIH/NIAMS till Martine Dunnwald (AR067739).
Materials
| 100% ethanol | |||
| 70% ethanol | |||
| 80% ethanol | |||
| 95% ethanol | |||
| Alcohol Prep | NOVAPLUS | V9100 | 70% Isopropyl alcohol, sterile |
| Ammonium hydroxide | |||
| Biopsy pads | Cellpath | 22-222-012 | |
| Black plastic sheet | Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper | ||
| Brightfield microscope | With digital acquisition capabilities and a 4X objective | ||
| Cotton tipped applicators | |||
| Coverslips | 22 x 60 #1 | ||
| Dental wax sheets | |||
| Digital camera | Include a ruler for scale, if applicable | ||
| Dissection teasing needle (straight) | |||
| Embedding molds | 22 x 22 x 12 | ||
| Embedding rings | Simport Scientific Inc. | M460 | |
| Eosin Y | |||
| Glacial acetic acid | |||
| Hair clipper | |||
| Heating pad | Conair | Moist dry Heating Pad | |
| Hematoxylin | |||
| Microtome | |||
| Microtome blades | |||
| Paint brushes | |||
| Paraffin Type 6 | |||
| Paraformaldehyde | |||
| Permount | |||
| Phosphate buffer solution (PBS) | |||
| Povidone-iodine | Aplicare | 82-255 | |
| Processing cassette | Simport Scientific Inc. | M490-2 | |
| Razor blades | ASR | .009 Regular Duty | |
| Scalpel blades #10 | |||
| Scalpel handle | |||
| Sharp surgical scissors | sterile for surgery | ||
| Skin biopsy punches | Size as determined by researcher | ||
| Slide boxes | |||
| Slide warmers | |||
| Superfrosted microscope slides | Fisher Scientific | 22 037 246 | |
| Temperature control water bath | |||
| Tissue embedding station | Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate | ||
| Tissue processor | Minimum of a oven with a vacuum pump | ||
| Triple antibiotic opthalmic ointment | |||
| tweezers, curved tip | sterile for surgery | ||
| tweezers, tapered tip | sterile for surgery | ||
| WypAll X60 | Kimberly-Clark | 34865 |
References
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
- Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models. Wound Repair Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).
- Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine Models for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
- Crowe, M. J., Doetschman, T., Greenhalgh, D. G. Delayed wound healing in immunodeficient TGF-beta 1 knockout mice. Journal of Investigative Dermatology. 115 (1), 3-11 (2000).
- Pietramaggiori, G., et al. Improved cutaneous healing in diabetic mice exposed to healthy peripheral circulation. Journal of Investigative Dermatology. 129 (9), 2265-2274 (2009).
- Cold Spring Harbor. Paraformaldehyde in PBS. Cold Spring Harbor Protocols. 1 (1), (2006).
- Gerharz, M., et al. Morphometric analysis of murine skin wound healing: standardization of experimental procedures and impact of an advanced multitissue array technique. Wound Repair Regeneration. 15 (1), 105-112 (2007).
- Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair Regeneration. 14 (1), 81-90 (2006).
- Le, M., et al. Transforming growth factor beta 3 is required for proper excisional wound repair in vivo. PLoS One. 7 (10), 48040 (2012).
- Sato, T., Yamamoto, M., Shimosato, T., Klinman, D. M. Accelerated wound healing mediated by activation of Toll-like receptor 9. Wound Repair Regeneration. 18 (6), 586-593 (2010).
- Martin, P., Leibovich, S. J. Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).
- Shaw, T. J., Martin, P. Wound repair: a showcase for cell plasticity and migration. Current Opinion in Cell Biology. 42, 29-37 (2016).
- Hoffman, M., Monroe, D. M. Low intensity laser therapy speeds wound healing in hemophilia by enhancing platelet procoagulant activity. Wound Repair Regeneration. 20 (5), 770-777 (2012).
- Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
- Uchiyama, A., et al. SOX2 Epidermal Overexpression Promotes Cutaneous Wound Healing via Activation of EGFR/MEK/ERK Signaling Mediated by EGFR Ligands. Journal of Investigative Dermatology. 139 (8), 1809-1820 (2019).
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Rhea, L., et al. Interferon regulatory factor 6 is required for proper wound healing in vivo. Developmental Dynamics. 249 (4), 509-522 (2020).
