在这里,我们描述了一种简单、廉价和快速的清除方法,通过荧光成像,使用标记的组合来可视化血管、核、免疫细胞、神经元和脂滴涂层蛋白,从而解析小鼠和人类白色脂肪组织的 3D 结构。
肥胖是一个主要的全球公共卫生问题,增加了患心血管疾病、2型糖尿病和肝病的风险。肥胖症的特点是脂肪组织 (AT) 质量增加,由于脂肪细胞增生和/或肥大,导致其三维结构的深刻重塑。事实上,在肥胖期间,AT的最大扩张能力对于肥胖相关病理学的发展至关重要。这种 AT 膨胀是一种重要的恒向机制,能够适应过多的能量摄入,并避免有害脂质溢出到其他代谢器官,如肌肉和肝脏。因此,了解导致 AT 扩展失败的结构重塑是临床适用性高的根本问题。在这篇文章中,我们描述了一种简单而快速的清除方法,在我们的实验室中经常使用这种方法,通过荧光成像来探索小鼠和人类白色脂肪组织的形态。这种优化的AT清除方法在任何配备化学罩、温度控制轨道摇床和荧光显微镜的标准实验室中都很容易实现。此外,使用的化合物是现成的。重要的是,此方法允许人们通过染色各种标记来专门可视化腺细胞、神经元和血管网络以及先天和自适应免疫细胞分布来解析 3D AT 结构。
肥胖症的特点是脂肪组织质量增加,并已成为一个重大的全球公共卫生问题,因为肥胖者患心血管疾病、2型糖尿病、肝病和一些癌症的风险增加。
脂肪组织的基本生理功能是调节全身葡萄糖和脂质平衡1,2。1,在喂养期间,脂肪细胞(即脂肪组织的主要细胞)将膳食提供的葡萄糖和脂质的过量储存到甘油三酯中。在禁食过程中,脂肪细胞将甘油三酯分解成非酯化脂肪酸和甘油,以维持身体的能量需求。在肥胖症的发育过程中,脂肪组织通过增加脂肪细胞的大小(肥大)和/或(增生)数量来扩大脂肪细胞1,以增加其储存能力。当脂肪组织的膨胀达到其极限时,患者中一个恒定的极易变量,剩余的脂质会积聚到其他代谢器官,包括肌肉和肝脏3、4,4导致其功能衰竭,并引发肥胖相关的心代谢并发症1,1,5。因此,确定控制脂肪组织扩张的机制是临床的关键挑战。
肥胖期间在脂肪组织内记录的形态修饰与其病理功能障碍有关。一些染色程序已经被用来描述脂肪组织的组织,包括行为素6,血管标记7,脂滴标记8,和特定的免疫细胞标记9,9,10。然而,由于脂肪细胞(50至200μm)的巨大直径11,因此必须从三维分析整个组织的很大一部分,以便准确分析肥胖期间观察到的戏剧性的结构 AT 变化。然而,由于光线不穿透不透明组织,因此不可能使用荧光显微镜在大型组织样本中进行3D成像。组织清除方法,使其透明已经报告在文献(审查,见12),允许一个人清除组织,并执行深入,整个组织荧光显微镜。这些方法为评估健康和患病组织中的 3D 细胞组织提供了前所未有的机会。每种描述的方法都有优点和缺点,因此需要根据所研究的组织仔细选择(如要回顾,见13)。事实上,有些方法需要长时间的潜伏期和/或使用昂贵,、有毒或难以获得的材料或化合物,例如14、15、16、17、18、19。,1516,17,18,19利用一个世纪前沃纳·斯帕尔特霍尔茨(Werner Spalteholz)用于清除组织20的第一批化合物之一,我们建立了一个用户友好且价格低廉的协议,非常适用于清除任何实验室中所有小鼠和人类脂肪组织库,这些实验室具有典型的设备,包括化学罩、温度控制轨道摇床和共生显微镜。
脂肪组织内在病理进展过程中发生的改变,如肥胖,对于理解病理背后的机制至关重要。揭示脂肪组织中这种机制的开创性研究基于全球方法,如全脂肪组织蛋白质组学21、流细胞学,22、23和转录组学24、25。,2522此外,还利用组织,学分析26、27、28、29,,<sup c…
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了 INSERM 的支持, 蔚蓝海岸大学,以及法国国家研究机构(ANR)通过未来实验室信号投资(ANR-11-LABX-0028-01)的资助,通过第2学院”Systémes复合体”和学院4″复杂与多样性”项目UCA JEDI(ANR-15-IDEX-01) Médical基金会(+quipe FRM DEQ20180839587)和J.G.青年调查员计划(ANR18-CE14-0035-01-GILLERON)。我们还感谢由阿尔卑斯海洋局和Région PACA委员会资助的C3M成像核心设施,该设施也得到IBISA显微镜和成像平台Céte d’Azur(MICA)的支持。我们感谢马里恩·杜索在组织准备方面提供的技术帮助。我们感谢艾比·卡特里斯,UCA国际科学能见度,为手稿的校对阅读。
1.5 mL microtubes | Eppendorff tubes – Dutscher | 33528 | |
15 mL plastic tubes | Falcon tubes – Dutscher | 352096 | |
18 mm round glass coverslip | Mariendfeld | 0117580 | |
20 mL glass bottle | Wheaton | 986546 | |
anti-mouse-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Dilution: 1/100 |
anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Dilution: 1/100 |
BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
CD301-PE antibody | Biolegend | BLE145703 | Dilution: 1/100 |
CD31 antibody | AbCam | ab215912 | Dilution: 1/50 |
Commercial 3D analysis software – IMARIS | Oxford instrument | with Cell module | |
Confocal microscope – Nikon A1R | Nikon | ||
Dapi | ThermoFisher | D1306 | Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000 |
Deoxycholate | Sigma-aldrich | D6750 | |
DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
Glut4 antibody | Santa Cruz | sc-53566 | Dilution: 1/50 |
Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice |
Metallic imaging chamber equipped with glass bottom – AttoFluor Chamber | Thermofisher | A7816 | |
Methyl salicylate | Sigma-aldrich | M6752 | |
Perilipin antibody | Progen | 651156 | Dilution: 1/50 |
Phalloidin-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Dilution: 1/100 |
TCR-β-PB antibody | Biolegend | BLE109225 | Dilution: 1/100 |
TH antibody | AbCam | ab112 | Dilution: 1/50 |
Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |