Untersuchung der Adipose-Gewebestruktur durch Methylsalicylat-Clearing und 3D-Bildgebung
Summary
Hier beschreiben wir eine einfache, kostengünstige und schnelle Clearing-Methode, um die 3D-Struktur von Maus- und menschlichem weiß-fettgewebe mithilfe einer Kombination von Markern zu lösen, um Vaskulatur, Kerne, Immunzellen, Neuronen und Lipid-Tröpfchen-Beschichtungsproteine durch fluoreszierende Bildgebung zu visualisieren.
Abstract
Adipositas ist ein weltweit wichtiges Problem der öffentlichen Gesundheit, das das Risiko erhöht, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Typ-2-Diabetes und Lebererkrankungen zu entwickeln. Adipositas ist durch eine Zunahme der Fettgewebemasse (AT) aufgrund von Adipozytenhyperplasie und/oder Hypertrophie gekennzeichnet, was zu einer tiefgreifenden Umgestaltung seiner dreidimensionalen Struktur führt. Tatsächlich ist die maximale Fähigkeit von AT, während Adipositas zu expandieren, von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung von Adipositas-assoziierten Pathologien. Diese AT-Erweiterung ist ein wichtiger homöostatischer Mechanismus, um die Anpassung an einen Überschuss an Energiezufuhr zu ermöglichen und schädliche Lipid-Spillover auf andere Stoffwechselorgane wie Muskel und Leber zu vermeiden. Daher ist das Verständnis der strukturellen Umgestaltung, die zum Scheitern der AT-Erweiterung führt, eine grundlegende Frage mit hoher klinischer Anwendbarkeit. In diesem Artikel beschreiben wir eine einfache und schnelle Clearing-Methode, die routinemäßig in unserem Labor verwendet wird, um die Morphologie von Maus und menschlichem weiß fettem Gewebe durch fluoreszierende Bildgebung zu erforschen. Diese optimierte AT-Clearing-Methode wird problemlos in jedem Standardlabor durchgeführt, das mit einer chemischen Haube, einem temperaturgeregelten Orbitalshaker und einem Fluoreszenzmikroskop ausgestattet ist. Darüber hinaus sind die verwendeten chemischen Verbindungen leicht verfügbar. Wichtig ist, dass diese Methode es ermöglicht, die 3D-AT-Struktur aufzulösen, indem verschiedene Marker gefärbt werden, um die Adipozyten, die neuronalen und vaskulären Netzwerke sowie die angeborene und adaptive Immunzellenverteilung gezielt zu visualisieren.
Introduction
Adipositas ist durch eine Zunahme der Fettgewebemasse gekennzeichnet und hat sich zu einem wichtigen weltweiten Problem der öffentlichen Gesundheit entwickelt, da Menschen mit Adipositas ein erhöhtes Risiko haben, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Typ-2-Diabetes, Lebererkrankungen und einige Krebsarten zu entwickeln.
Eine grundlegende physiologische Funktion des Fettgewebes ist es, Ganzkörperglukose und Lipidhomöostase1,2zu modulieren. Während der Fütterungszeit speichern die Adipozyten (d. h. die Hauptzellen des Fettgewebes) den Überschuss an Glukose und Lipiden, die durch eine Mahlzeit in Triglyceride bereitgestellt werden. Während des Fastens brechen die Adipozyten die Triglyceride in nicht veresterte Fettsäuren und Glycerin auf, um den Energiebedarf des Körpers zu decken. Während der Entwicklung von Adipositas, Fettgewebe erweitern, indem sie die Größe (Hypertrophe) und/oder die Anzahl (Hyperplasie) der Adipozyten1, um ihre Speicherkapazität zu erhöhen. Wenn die Ausdehnung des Fettgewebes an seine Grenze stößt, eine konstante, sehr variable unter den Patienten, akkumulieren sich die verbleibenden Lipide in anderen Stoffwechselorganen einschließlich Muskeln und Leber3,4, was zu ihrem funktionellen Versagen führt und adipositasbedingte kardiometabolische Komplikationen einleitet1,5. Daher ist die Identifizierung der Mechanismen, die die Fettgewebeexpansion steuern, eine zentrale klinische Herausforderung.
Die morphologischen Veränderungen, die während der Fettleibigkeit in Fettgewebe dokumentiert werden, sind mit seiner pathologischen Dysfunktion verbunden. Mehrere Färbungsverfahren wurden verwendet, um die Gewebeorganisation des Fettgewebes zu beschreiben, einschließlich Actin6, Gefäßmarker7, Lipid-Tröpfchen-Marker8, und spezifische Immunzellmarker9,10. Aufgrund des enormen Durchmessers von Adipozyten (50 bis 200 m)11ist es jedoch wichtig, einen großen Teil des gesamten Gewebes in drei Dimensionen zu analysieren, um die dramatischen strukturellen AT-Veränderungen, die während Adipositas beobachtet wurden, genau zu analysieren. Da das Licht jedoch nicht in ein undurchsichtiges Gewebe eindringt, ist eine Bildgebung in 3D innerhalb einer großen Gewebeprobe mittels Fluoreszenzmikroskopie nicht möglich. Methoden der Geweberäumung, um sie transparent zu machen, wurden in der Literatur berichtet (für eine Überprüfung, siehe12), die es einem ermöglichen, Gewebe zu löschen und eine gründliche, ganzgewebte Fluoreszenzmikroskopie durchzuführen. Diese Methoden bieten beispiellose Möglichkeiten, die 3D-Zellorganisation in gesundem und krankem Gewebe zu bewerten. Jede der beschriebenen Methoden hat Vor- und Nachteile und muss daher je nach untersuchtem Gewebe sorgfältig ausgewählt werden (für eine Überprüfung siehe13). In der Tat erfordern einige Ansätze eine lange Inkubationszeit und/oder die Verwendung von Materialien oder Verbindungen, die entweder teuer, toxisch oder schwer zu erhalten sind14,,15,16,17,18,19. Unter Ausnutzung einer der ersten Verbindungen, die Werner Spalteholz vor einem Jahrhundert zur Reinigung von Geweben20verwendet hat, haben wir ein benutzerfreundliches und kostengünstiges Protokoll eingerichtet, das sehr gut für die Räumung aller Maus- und menschlichen Fettgewebedepots in jedem Labor mit typischen Geräten wie einer chemischen Haube, einem temperaturgeregelten Orbitalshaker und einem konfokalen Mikroskop geeignet ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Veränderungen, die im Verlauf des pathologischen Verlaufs des Fettgewebes auftreten, wie die von Adipositas, sind für das Verständnis der Mechanismen hinter der Pathologie von grundlegender Bedeutung. Wegweisende Studien, die solche Mechanismen im Fettgewebe aufdeckten, basierten auf globalen Ansätzen wie der gesamten Fettgewebeproteomik21, der Durchflusszytometrie22,23und der Transkriptomik24,<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt von INSERM, Université Céte d’Azur, und durch Stipendien der französischen Nationalen Forschungsagentur (ANR) über die Investitionen für die Zukunft Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), das Programm UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) über Academy 2 “Systémes Complexes” und Academy 4 “Complexité et diversité du vivant”, Fondation pour la Recherche Médical (Equipe FRM DEQ20180839587) und das Young Investigator Program to J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON ). Wir danken auch der Imaging Core Facility von C3M, die vom Conseil Départemental des Alpes-Maritimes und der Région PACA finanziert wird und die auch von der IBISA-Plattform für Mikroskopie und Bildgebungsplattform Céte d’Azur (MICA) unterstützt wird. Wir danken Marion Dussot für die technische Hilfe bei der Gewebeaufbereitung. Wir danken Abby Cuttriss, UCA International Scientific Visibility, für die beweissichere Lektüre des Manuskripts.
Materials
| 1.5 mL microtubes | Eppendorff tubes – Dutscher | 33528 | |
| 15 mL plastic tubes | Falcon tubes – Dutscher | 352096 | |
| 18 mm round glass coverslip | Mariendfeld | 0117580 | |
| 20 mL glass bottle | Wheaton | 986546 | |
| anti-mouse-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Dilution: 1/100 |
| anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Dilution: 1/100 |
| BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
| CD301-PE antibody | Biolegend | BLE145703 | Dilution: 1/100 |
| CD31 antibody | AbCam | ab215912 | Dilution: 1/50 |
| Commercial 3D analysis software – IMARIS | Oxford instrument | with Cell module | |
| Confocal microscope – Nikon A1R | Nikon | ||
| Dapi | ThermoFisher | D1306 | Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000 |
| Deoxycholate | Sigma-aldrich | D6750 | |
| DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
| Glut4 antibody | Santa Cruz | sc-53566 | Dilution: 1/50 |
| Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
| Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice |
| Metallic imaging chamber equipped with glass bottom – AttoFluor Chamber | Thermofisher | A7816 | |
| Methyl salicylate | Sigma-aldrich | M6752 | |
| Perilipin antibody | Progen | 651156 | Dilution: 1/50 |
| Phalloidin-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Dilution: 1/100 |
| TCR-β-PB antibody | Biolegend | BLE109225 | Dilution: 1/100 |
| TH antibody | AbCam | ab112 | Dilution: 1/50 |
| Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |
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