Summary
Burada, hem fare hem de insan beyaz yağ dokusunun 3Boyutlu yapısını çözüme kavuşturmak için basit, ucuz ve hızlı bir temizleme yöntemi tanımlıyoruz.
Abstract
Obezite kardiyovasküler hastalıklar, tip-2 diyabet ve karaciğer hastalıkları geliştirmek için risk artar önemli bir dünya çapında halk sağlığı sorunudur. Obezite, adiposit hiperplazi ve/veya hipertrophiye bağlı yağ dokusu (AT) kütlesindeki artış ile karakterizedir ve üç boyutlu yapısının derin bir şekilde yenilenmesine yol açar. Gerçekten de, obezite sırasında genişletmek için AT maksimal kapasitesi obezite ile ilişkili patolojilerin gelişimi için çok önemlidir. Bu AT genişleme ve enerji alımının aşırı adaptasyon sağlamak için önemli bir homeostatik mekanizma diğer metabolik organlara zararlı lipid dökülmesini önlemek için, kas ve karaciğer gibi. Bu nedenle, AT genişlemesinin başarısızlığına yol açan yapısal yeniden şekillendirmenin anlaşılması, yüksek klinik uygulanabilirliği olan temel bir sorudur. Bu makalede, floresan görüntüleme ile fare ve insan beyaz yağ dokusunun morfolojisini keşfetmek için rutin olarak laboratuarımızda kullanılan basit ve hızlı bir temizleme yöntemini açıklıyoruz. Bu optimize AT temizleme yöntemi kolayca bir kimyasal başlık, sıcaklık kontrollü orbital shaker ve floresan mikroskop ile donatılmış herhangi bir standart laboratuvarda gerçekleştirilir. Ayrıca, kullanılan kimyasal bileşikler kolayca kullanılabilir. Daha da önemlisi, bu yöntem özellikle adipositler, nöronal ve vasküler ağlar ve doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık hücreleri dağılımı görselleştirmek için çeşitli belirteçleri boyama tarafından 3D AT yapısını çözmek için izin verir.
Introduction
Obezite yağ dokusu kütlesinde bir artış ile karakterizedir ve önemli bir dünya çapında halk sağlığı sorunu haline gelmiştir, obezite olan kişilerin kardiyovasküler hastalık gelişme riskini artırdığı göz önüne alındığında, tip-2 diyabet, karaciğer hastalıkları ve bazı kanserler.
Yağ dokusunun temel fizyolojik fonksiyonu tüm vücut glikoz ve lipid homeostazı modüle etmektir1,2. Beslenme döneminde, adipositler (yani, yağ dokusunun ana hücreleri) trigliserid içine bir yemek tarafından sağlanan glikoz ve lipidlerin aşırı depolar. Oruç sırasında, adipositler vücudun enerji talebini sürdürmek için esterleştirilmiş olmayan yağ asitleri ve gliserol içine trigliserid yıkmak. Obezite gelişimi sırasında, yağ dokusu büyüklüğü artırarak genişletmek (hipertrophi) ve / veya sayı (hiperplazi) adipositler1, depolama kapasitesini artırmak için. Yağ dokusunun genişlemesi sınırına ulaştığında, hastalar arasında sürekli bir son derece değişken, kalan lipidler kas ve karaciğer 3 dahil olmak üzere diğer metabolik organlara birikir3,4, fonksiyonel yetmezliğine yol açan ve obezite ile ilgili kardiyo-metabolik komplikasyonlar başlatılması1,5. Bu nedenle, yağ dokusu genişlemesi yöneten mekanizmaların belirlenmesi önemli bir klinik sorundur.
Obezite sırasında yağ dokularında belgelenen morfolojik modifikasyonlar patolojik disfonksiyonu ile bağlantılıdır. Çeşitli boyama prosedürleri adipoz doku organizasyonu tanımlamak için kullanılmıştır, aktin dahil6, vasküler belirteçleri7, lipid damlacık belirteçleri8, ve spesifik bağışıklık hücre belirteçleri9,10. Ancak, adipositlerin büyük çapı nedeniyle (50-200 μm)11, obezite sırasında gözlenen dramatik yapısal AT değişiklikleri doğru analiz etmek için üç boyutlu tüm doku büyük bir bölümünü analiz etmek esastır. Ancak, ışık opak bir doku nüfuz etmez çünkü, floresan mikroskopi kullanarak büyük bir doku örnekleri içinde 3D görüntüleme mümkün değildir. Doku temizleme yöntemleri onları şeffaf hale getirmek için literatürde bildirilmiştir (bir inceleme için, bakınız12) dokuları temizlemek ve derinlemesine gerçekleştirmek için izin, tüm doku floresan mikroskopi. Bu yöntemler sağlıklı ve hastalıklı dokuda 3D hücresel organizasyonu değerlendirmek için benzeri görülmemiş fırsatlar sunar. Açıklanan yöntemlerin her birinin avantajları ve dezavantajları vardır ve bu nedenle incelenen dokuya bağlı olarak dikkatle seçilmesi gerekir (gözden geçirme içinbkz. 13). Nitekim, bazı yaklaşımlar uzun bir kuluçka dönemi ve / veya pahalı, toksik ya da 14,15,16,,17,18,19elde etmek zor malzeme veya bileşiklerin kullanımını gerektirir.19 Bir yüzyıl önce Werner Spalteholz tarafından dokuları temizlemek için kullanılan ilk bileşiklerden birinden yararlanarak20, biz çok iyi bir kimyasal başlık, bir sıcaklık kontrollü orbital shaker ve konfokal mikroskop da dahil olmak üzere tipik ekipman ile herhangi bir laboratuvarda tüm fare ve insan yağ dokusu depolarının temizlenmesi için uyarlanmış bir kullanıcı dostu ve ucuz protokol kurmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol test edildi ve tüm fare ve insan beyaz yağ dokusu depoları için doğrulanmıştır. İnsan ve fare yağ dokuları Avrupa yasalarına göre toplanmış ve Fransız ve İsveç Etik komiteleri tarafından onaylanmıştır.
1. Fare ve insan beyaz yağ dokusufiksasyonu
- Hasat edilen fareyi veya insan beyaz yağ dokularını 15 mL plastik tüpe %4 paraformaldehit (PFA) içeren en az 10 mL PBS'ye batırın.
- 1 saat boyunca bir haddeleme plaka üzerinde oda sıcaklığında plastik tüp çalkalayın.
- Fiksasyonu tamamlamak için plastik tüpü bir gecede yuvarlanan bir plakaüzerinde 4 °C'de bırakın.
NOT: Bu protokol, normal bir diyetle beslenen farelerden elde edilen tüm epididimal yağ pedleri gibi büyük yağ dokusu örnekleri için uyarlanmıştır (≈250 mg - ≈0.6 cm3). Yüksek yağlı diyet (≈1,5 g - ≈4 cm3)veya insan yağ dokusu örneklerinden beslenen farelerden elde edilen epididimal yağ pedleri gibi daha büyük numuneler için, temizleme protokolü tüm numune için mükemmel bir şekilde çalışmalıdır (PFA ve antikor karışımlarını ölçeklendirerek) genel olarak, kalan örnekleri ek boyama veya uygulamalar için ayırmak için 1 g (≈2,5 cm3)civarında doku parçaları kesiyoruz. PFA (adım 1.1.) için doku hacminin yaklaşık 10 katını kullanmanızı öneririz. Antikor karışımları için (adımlar 3.1. ve 3.4.), tamamen doku batırmak için hacmi artırmak ve doku 1,5 mL plastik mikrotüp için çok büyük ise 15 mL plastik tüp (Malzemeler Tablosubakınız) kullanın (Malzemeler Tablosubakınız).
2. Fare ve insan beyaz yağ dokusunun permeabilizasyonu ve doygunluğu
- PfA'nın tüm izlerini çıkarmak için sabit beyaz yağ dokusunu 10 mL PBS'de oda sıcaklığında 5 dakika boyunca durulayın.
- % 0,3 glisin ile desteklenen PBS 10 mL içeren 15 mL plastik tüp doku batırın (Malzemeler Tablosubakınız) ve kalan serbest aldehit grupları bastırmak için 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 00 00 00 00 00 000 için bir orbital shaker oda sıcaklığında tüp sallamak.
- Dokuyu %0,2 Triton X-100 ile desteklenen 10 mL PBS içeren 15 mL plastik bir tüpe batırın (Malzeme Tablosu'nabakın) ve 100 rpm'de 2 saat sıcaklık kontrollü orbital shaker'da tüpü 37 °C'de sallayın.
- % 0.2 Triton X-100 ve% 20 DMSO ile desteklenen PBS 10 mL içeren 15 mL plastik tüp doku batırın (Malzeme Tablosubakınız) ve bir gecede 100 rpm bir sıcaklık kontrollü orbital shaker 37 °C tüp sallayın.
- Dokuyu %0,1 Ara-20 ile desteklenen 10 mL PBS içeren 15 mL plastik bir tüpe daldırın (Bkz. Malzemeler Tablosu),%0,1 Triton X-100, %0,1 deoksikolate (Bkz. Malzemeler Tablosu)ve %20 DMSO'da tüpü 37 °C'de 100 rpm'de en az 24 saat boyunca sallayın.
- PBS 10 mL içeren 15 mL plastik tüp içinde doku durulayın 0.2% Triton X-100 ile takviye ve 1 00 rpm bir orbital shaker oda sıcaklığında tüp sallamak 1 saat.
- % 0.2 Triton X-100, %10 DMSO ve %3 BSA (Bkz. Malzemeler Tablosu)ile desteklenen 10 mL PBS içeren 15 mL plastik bir tüpe dozu batırın ve 12 saat boyunca 100 rpm sıcaklık kontrollü orbital shaker'da tüpü 37 °C'de sallayın ve özellikle antiorları bağlamayan bölgeleri doygunlaştırın.
NOT: Adım 2.7'de BSA, kullanılan ikincil antikor türünün kan serumu ile değiştirilebilir.
3. Fare ve insan beyaz yağ dokusu için boyama işlemi
- 300 μL PBS içeren ve %0.2 Triton X-100, %10 DMSO, %3 BSA ve primer antikorlar içeren 1.5 mL plastik mikrotüpteki dokuyu transfer edin (kriyozeksiyon boyamasına göre 10 kat daha fazla konsantre ancak her antikor için optimal antikor konsantrasyonu değerlendirilmelidir). Tüpü alüminyum folyo ile kaplayarak ışıktan koruyun ve en az iki gün boyunca 100 rpm sıcaklık kontrollü orbital shaker'da 37 °C'de tüpü sallayın (adım 1.1 ve adım 3.7.1'deki nota bakın).
- 10 mL PBS içeren 15 mL plastik tüpteki dokuyu %0,2 Triton X-100, %10 DMSO ve %3 BSA ile durulayın ve 37 °C'de ışıktan korunan tüpü 100 rpm'de 5 saat boyunca 100 rpm'de çalkalayın. Bu adımı iki kez gerçekleştirin.
- 10 mL PBS içeren 15 mL plastik tüpteki dokuyu %0,2 Triton X-100, %10 DMSO ve %3 BSA ile durulayın ve ışıktan korunan tüpü 37 °C'de bir gece ile iki gün boyunca 100 rpm sıcaklık kontrollü orbital shaker'da çalkalayın.
- Dokuyu %0.2 Triton X-100, %10 DMSO, %3 BSA ve sekonder antikorlarla desteklenen 300 μL PBS içeren 1.5 mL plastik mikrotüpe aktarın (kriyozeksiyon boyamaya göre 10 kat daha fazla konsantre). Tüpü alüminyum folyo ile kaplayarak ışıktan koruyun ve en az iki gün boyunca 100 rpm sıcaklık kontrollü orbital shaker'da 37 °C'de tüpü sallayın (adım 1.1 ve adım 3.7.1'deki nota bakın).
- 10 mL PBS içeren 15 mL plastik tüpteki dokuyu %0,2 Triton X-100, %10 DMSO ve %3 BSA ile durulayın ve ışıktan korunan tüpü 37 °C'de, 100 rpm'de 5 saat boyunca 100 rpm'de çalkalayın. Bu adımı iki kez gerçekleştirin.
- 10 mL PBS içeren 15 mL plastik tüpteki dokuyu %0,2 Triton X-100, %10 DMSO ve %3 BSA ile durulayın ve ışıktan korunan tüpü 37 °C'de bir gece den iki güne kadar 100 rpm'de çalkalayın.
- 10 mL PBS içeren 15 mL plastik bir tüpteki dokuyu durulayın ve ışıktan korunan tüpü 37 °C'de 100 rpm'de 2 saat boyunca çalkalayın.
NOT: Çekirdek veya aktin gibi belirli yapıların etiketlenmesi için, 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI veya eşdeğeri) ekleyin ve/veya floresan etiketli-phalloidin adım 3.1'e eklenmeli. sadece floresan etiketli primer antikorlar kullanıldığında veya adım 3.4'te kullanılır. ikincil antikorlar kullanıldığında.
NOT: Boyama işlemi için florokromlarla konjuge olmuş primer antikorlar (akış sitometrisi için kullanılanlar gibi) kullanılabilir ve zaman ve özgüllük kazanmak için tavsiye edilir. Gerçekten de, fare primer antikorları ikincil anti-fare antikorları tarafından kullanılabilse bile, burada gösterdiğimiz gibi, sirkülasyon immünglobulin nedeniyle kan damarlarının spesifik olmayan boyanması sıklıkla gözlendik. Bu nedenle, bu sorunu önlemek için, zaten etiketli birincil antikorlar şiddetle tavsiye edilir ve burada akış sitometrisinde kullanılan antikorların prosedürümüzle uyumlu olduğuna dair kanıtlar salıyoruz. Ancak, düşük seviyelerde ifade edilen bir antijenin özel durumunda, ikincil antikorlar yoluyla sinyal amplifikasyon adımı zorunludur; farede mevcut tek primer antikor yapıldığında, pbs ile farelerin kurban en az 5 dakika kardiyak perfüzyon dolaşan immünglobulin büyük bir oranda ve böylece non-spesifik boyama kaldırabilirsiniz.
4. Fare ve insan beyaz yağ dokusu için temizleme prosedürü
- 10 mL%50 etanol içeren 15 mL plastik bir tüpe dokuyu batırın ve 2 saat boyunca 100 rpm'de oda sıcaklığında ışıktan korunan tüpü sallayın.
- 10 mL%70 etanol içeren 15 mL plastik bir tüpe dokuyu batırın ve 2 saat boyunca 100 rpm'de oda sıcaklığında ışıktan korunan tüpü sallayın.
- 10 mL%95 etanol içeren 15 mL plastik bir tüp doku batırın ve 2 saat için 100 rpm bir orbital shaker oda sıcaklığında, ışıktan korunan tüp sallayın.
- 10 mL%100 etanol içeren 15 mL plastik bir tüpe dokuyu batırın ve 2 saat boyunca 100 rpm'de oda sıcaklığında ışıktan korunan tüpü sallayın.
- 10 mL%100 etanol içeren 15 mL plastik bir tüp doku batırın ve tüp sallayın, ışıktan korunan, oda sıcaklığında bir orbital shaker bir orbital shaker bir gecede.
- Bir kimyasal başlık altında 5 mL metil salisilat (Malzemeler Tablosubakınız) içeren plastik bir kap ile 20 mL cam şişe (malzemelerin tablobakınız) doku batırın ve en az 2 saat için 100 rpm bir orbital shaker oda sıcaklığında, ışıktan korunan cam konteyner sallayın.
NOT: Temizleme işlemi 4.3 adımlarından kaçınılarak (gerekirse) önemli ölçüde hızlandırılabilir. ve 4.5., son temizleme kalitesi biraz azaltılmış olsa da.
5.3D-konfokal görüntüleme temizlenmiş beyaz yağ dokusu
- Kimyasal bir başlık altında bir cam alt ile donatılmış metalik bir görüntüleme odasına doku aktarın (Malzemeler Tablosubakınız) ve taze metil salisilat ile oda doldurun.
NOT: Dokuyu yerinde sabitlemek ve böylece odada yüzer veya yan lara doğru hareket etmesini önlemek için, odaya monte ederken dokunun üzerine birden fazla 18 mm yuvarlak cam kapak lı dudak (Bkz. Malzeme Tablosu)uygulayın. - Görüntüleme odasını ters bir konfokal mikroskoba yerleştirin.
- Tüm yağ dokusunun veya insan doku örneğinin birkaç cm3 3D haritasını oluşturmak için düşük büyütme hedefi (örn. 4x objective) kullanarak dokuyu görüntüleyin.
- Daha yüksek büyütme de doku örnekleme için çeşitli alanlar seçin. Tipik olarak, çözünürlük ve derinlik arasında iyi bir oran sağlayan 20x uzun mesafe hava hedefi kullanın. 600 ile 2000 m derinliğinde z-yığınları olan büyük mozaik görüntüler elde ediyoruz.
NOT: Dokudaha derin görüntü için uzun mesafe hedefi kullanın.
6. 3D yağ dokusu görüntülerinden nicel sonuçların çıkarılması
NOT: Farklı yapıların bölümlenmesi ve 5. Aşağıdaki noktalarda, rutin olarak ticari yazılım kullanarak 3D yağ dokusu görüntülerinden nicel bilgi ayıklamak için laboratuarımızda kullanılan bir stratejiyi açıklıyoruz (bkz.
- 3B yığınları yazılım biçimine dönüştürerek bellek alanını boşaltın.
- Hücreleri böl.
- Yazılımın Hücre modülünün açın.
- Hücre Algılama ayarını plazma membran boyama ile değiştirin.
- Hücre çevresini (makrofaj için F4/80 gibi kortikal aktin veya plazma membran belirteçlerini etiketler, T hücreleri için TCR-β veya bağışıklık hücresi alt tiplerine özgü farklılaşma CD proteinlerinin kümesini etiketler) gösteren belirteçlerin floresan kanalını seçin.
- Eşikleri ayarlayın ve beklenen hücre boyutu aralığı sağlayın (örn. hücre algılaması için 1 ila 200 m).
- Segmentasyonu çalıştırın. Z yığınına karşılık gelen bir birim, komşu hücrelerin her biri için farklı bir renkle renk kodlu parçalı hücrelerle oluşturulur.
- İstatistik sekmesine istatistiksel filtreler (boyut, yuvarlaklık, dairesellik vb.) uygulayArak segmentasyon eserlerini hariç tutup/veya segmente edilmiş hücreleri boyutlarına göre (yani adipositler için 20-200 m; makrofajlar için 5-25 μm; lenfositler için 1-3 μm) ilgi hücresine rafine etmek için uygulayın.
- İstatistik sekmesinden ölçümler ve nicel veriler (hacim, sayı, boyut, çap, vb.) ayıklayın.
- Segment hücresel bileşenleri (çekirdekler, veziküller, vb) veya bir yapı olarak damarlar.
NOT: Filament segmentasyonu damarların bağlantılarını incelemek için çok yararlı olsa da, damarların büyüklüğü, hacmi ve çapları hakkında veri ayıklamak için yüzey modülü segmentasyonunu kullanırız. Gerçekten de, filamanmodülü kullanılırken damarların boyutlarının nicelikselleştirilmesi kaybolur.- Yazılımın Yüzey modülünün açın.
- 3B olarak yeniden oluşturmak için hücre altı bileşenini özellikle etiketlemek için kullanılan işaretçinin floresan kanalını seçin.
- Eşikleri ayarlayın ve yapının beklenen çap boyutu (örneğin, çekirdekler için 0,5-5 μm; damarlar için 0-100 μm; vb. ) bir dizi sağlayın.
- Segmentasyonu çalıştırın. Parçalı hücresel yapıya sahip bir hacim oluşturulacaktır. İstatistik sekmesinden ölçümler ve nicel veriler (hacim, sayı, boyut, çap vb.) çıkarılabilir.
- Gemileri borusal bir süreklilik olarak ayırın.
NOT: Filament segmentasyonu damarların bağlantılarını incelemek için çok yararlı olsa da, damarların büyüklüğü, hacmi ve çapları hakkında veri ayıklamak için yüzey modülü segmentasyonunu kullanırız. Gerçekten de, filamanmodülü kullanılırken damarların boyutlarının nicelikselleştirilmesi kaybolur.- Yazılımın Filamentler modülünün açın.
- Damar boyama karşılık gelen floresan kanal seçin.
- Floresan yoğunluğu için eşikleri ayarlayın ve uygun sayıda beklenen bağlantı düğümünü seçin.
- Segmentasyonu çalıştırın. Damar ağını temsil eden iplikler 3Boyutlu olarak üretilecektir. Ölçümler istatistik sekmesinden çıkarılabilir, damar uzunluğu, damar dallanma sayısı, vb dahil olmak üzere nicel veri elde etmek için izin
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada açıklanan ve Şekil 1'deözetlenen prosedürü kullanarak, şekil 2A ve Şekil 2B'desunulan insan ve fare beyaz yağ dokusunu sırasıyla lekelebildik ve optik olarak temizleyebildik. Temizlenen doku konfokal görüntüleme yapmak için metalik görüntüleme odasına transfer edildi(Şekil 3A). Açıklık, elde edebildiğimiz doku görüntülerinin derinliğini büyük ölçüde iyileştirmiştir(Şekil 3B ve Şekil 3C). Tüm yağ dokusu 4x hedefi kullanılarak düşük büyütme de 3D olarak elde edilebilir (Ek Film 1 bakınız), bir 3D harita oluşturmak için, 20x hedefi kullanarak yüksek büyütme elde edilecek farklı alanları seçmek için sağlayan (Şekil 3D). Yüksek büyütme görüntüleri 2 mm derinliğe sahip 3Boyutlu olarak elde edilir(Şekil 3E).
Bu prosedür floresan etiketli Phalloidin kullanarak DAPI ve aktin kullanarak çekirdekleri de dahil olmak üzere çok sayıda genel hücre belirteçleri, etiketleme sağlar. Lipid damlacıkları ve adipositlerin spesifik boyanması perilipin antikor kullanılarak elde edilebilir (bkz. malzeme tablosu; Şekil 4A) ve anti-Glut4 antikor (malzemelerin tablo bakınız; Şekil 4B) Sıra -sıyla. Kan damarları YA CD31 antikor kullanılarak tespit edilebilir (malzemelerin tablobakınız; Şekil 4C) veya fare kurban kesmeden kısa bir süre önce lektin-DyLight649'un intravenöz enjeksiyonu ile (bkz. malzeme tablosu; Şekil 4D). Makrofajlar ve T-hücreleri anti-CD301-PhycoErythrin antikor kullanılarak görselleştirilebilir (malzemelerin tablosuna bakın; Şekil 4D) ve anti-TCR-β-Pasifik Bleu antikor (malzemelerin tablobakınız; Şekil 4E). Periferik sinir ağı anti-Tirozin Hidroksilaz kullanılarak tespit edilebilir (TH) antikor (malzemelerin tablo bakınız; Şekil 4F-G). Ayrıca, bu protokol fare epididimal yağ dokusunun temizlenmesini sağlar (Şekil 4A-B,E), fare deri altı yağ dokusu (Şekil 4D,G), fare kahverengi yağ dokusu (Şekil 4F), ve insan yağ dokusu (Şekil 4C). Bu etiketleme ve ticari bir yazılım (malzeme tablosuna bakınız) bu işaretleri segmente kullanarak, yağ dokusu i) yağ dokusu içinde boyut ve boyut dağılımı anlamına belirleyebilirsiniz(Şekil 5A-B) ve ii) kan damarı ağ yoğunluğu(Şekil 5C).
Şekil 1: Beyaz yağ dokusu için temizleme işleminin özeti. Fare veya insan beyaz yağ dokuları sabit, permeabilized, doymuş, lekeli ve temizlenir. Görüntüler daha sonra 3D olarak elde edilir ve ticari bir yazılım kullanılarak analiz edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Beyaz yağ dokusufotoğrafları. (A) Temizleme işleminden önce ve sonra insan beyaz abdominopelvik yağ dokusufotoğrafı. (B) Temizleme işleminden önce ve sonra fare epididimal beyaz yağ dokusunun fotoğrafı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Yağ dokusu nun temizlenmesi ile geliştirilmiş görüntüleme derinliği. (A) Cam alt ile donatılmış metalik görüntüleme odasının montajı. (B) Phalloidin-Alexa488 (yeşil) ile boyanmış fare epididimal beyaz yağ dokusunun Z-serisi görüntüleri temizlemeden önce ve sonra. (C) B z-yığını panelindeki beyaz noktalı çizgilere karşılık gelen XZ projeksiyonları. (D) Phalloidin-Alexa488 kullanılarak aktin için boyanmış ve 4x amacı ile düşük büyütme de elde edilen fare deri altı beyaz yağ dokusu0.4 cm z-yığın Z-projeksiyon. Sağdaki küçük görüntüler 20x hedefi kullanılarak seçilen doku pozisyonunda elde edildi. (E) Phalloidin-Alexa488 ile boyanmış temizlenmiş fare beyaz yağ dokusundan görüntü z-yığınının 3D hacim işleme yan görünümü 20x görüntüleri benzer elde (D). Yüksek büyütme prosedürümüzle elde edilen 3D görüntüleme derinliği burada gösterilmiştir ve z derinliği renk kodlaması ile altı çizilir (z=0 mm için koyu mavi, z=2 mm için koyu kırmızı). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Fare ve insan beyaz yağ dokuları çeşitli belirteçler için boyanmış. (A) Anti-perilipin1 antikor ve anti-fare-alexa647 konjuge antikor kullanarak lipid damlacıkları için boyanmış fare epididimal beyaz yağ dokusunun tek düzlem görüntüsü. (B) DAPI, anti-Glut4 antikor ve anti-fare-alexa647-konjuge antikor kullanarak çekirdek ve adipositler için boyanmış fare epididimal beyaz yağ dokusumozaik tek düzlem görüntüsü. (C) CD31-alexa647-konjuge antikor kullanan damarlar için lekeli insan beyaz abdominopelvik yağ dokusu600 μm z-yığın Z-projeksiyon. (D) Lektin-DyLight649 intravenöz enjeksiyonlar ve anti-CD301-alexa555 antikor kullanılarak damarlar ve makrofajlar için boyanmış 600 μm z-deste fare deri altı beyaz yağ dokusunun Z-projeksiyonu. Sağ alt inset beyaz noktalı kutunun yakınlaştırılmış bir görüntüdür. (E) Phalloidin-Alexa488 ve anti-TCRβ-Pasifik mavi konjuge kullanarak aktin ve T hücreleri için boyanmış fare epididimal beyaz yağ dokusunun tek düzlem görüntüsü. Sağ alt inset beyaz noktalı kutunun yakınlaştırılmış bir görüntüdür. (F) DAPI, anti-TH antikor ve anti-tavşan-alexa647-konjuge antikor kullanarak çekirdekve nöronal ağ için boyanmış fare kahverengi yağ dokusu 50 μm z-yığın Z-projeksiyon. (G) DAPI, anti-TH antikor ve anti-tavşan-alexa647-konjuge antikor kullanarak çekirdekleri ve nöronal ağ için boyanmış fare deri altı beyaz yağ dokusunun 600 μm z-yığın Z-projeksiyon. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Ticari olarak kullanılabilen yazılımları kullanarak 3B görüntülerin analizi (bkz. malzeme tablosu). (A) ticari olarak kullanılabilen yazılımlar tarafından 3B olarak bölümlenen insan adipositlerinin 3Boyutlu hacim işlemesi. Her adiposit, bitişik adipositler temas farklı bir renge sahiptir. Gemiler kırmızı ile temsil edilir. (B) A panelinin 3Boyutlu hacim işlemesinden adipositlerin boyut niceliği ve dağılımı, yaklaşık 20.000 adiposit içerir. (C) 3D hacimli kan damarlarının ticari olarak kullanılabilen yazılımlar kullanılarak 3Boyutlu olarak işlenmesi ve büyük ve küçük damarlar için sırasıyla kırmızı veya sarı renkte temsil edilmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Film 1: Şekil 3D'degösterilen tüm deri altı beyaz yağ dokusunun 3Boyutlu hacim işlemesi . Beyaz kutu 2 cm3 küptemsil eder. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Obezite gibi patolojik ilerleme boyunca yağ dokusu içinde meydana gelen değişiklikler, patolojinin arkasındaki mekanizmaların anlaşılmasında temel dir. Yağ dokusunda bu tür mekanizmaları ortaya öncü çalışmalar gibi tüm yağ dokusu proteomics21gibi küresel yaklaşımlara dayalı olmuştur , akış sitometri22,23, ve transkripsiyon24,25. Buna ek olarak, histolojik analizler26,27,2828,29kullanılarak yağ dokusunda meydana gelen yapısal değişiklikleri araştırmak için çaba gösterilmiştir. Ancak, 5-10 μm yağ dokusu bölümlerinin analizi, bölümün sınırlı boyutu nedeniyle, önemli yapısal özellikleri takdir yeteneğini kısıtlar. İlk olarak, her bölüm adipositlerin sadece küçük bir kısmını temsil ettiği için bölüm başına sadece birkaç adiposit çekirdeği saptanabilir (1/10th). İkinci olarak, adipos doku bölümlerinden tahmin edilen adipositlerin boyutu yanlıştır, çünkü çoğu adiposit ekvatorunun altında veya arkasında kesilir ve bu da ortalama boyutlarının önyargılı (altında) ölçülmelerine yol açar. Üçüncü olarak, kan damarı ve sinir lifi sürekliliği fiziksel kesit sırasında kaybolur. Dördüncü olarak, üç boyutlu koordinatlar kaybolur çünkü doku içinde bağışıklık hücrelerinin her alt tip dağılımı kurmak zordur. Bu bağlamda, burada önerdiğimiz metodoloji herhangi bir standart laboratuvar görüntü insan ve fare beyaz yağ dokusu üç boyutlu, basit ve ucuz bir şekilde sağlar.
Bu yöntemin bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, doku hazırlamak için gerekli zaman (fiksasyon, permeabilization, boyama, temizleme) uzun (bir haftadan fazla). Bu zaman çoğunluğu doku leke için gerekli olduğu için bu azaltmak zor olacaktır. Bu tür büyük doku örnekleri içinde antikorların penetrasyonu uzun kuluçka süreleri gerektirir. Kuluçka süresinin azaltılması homojen olmayan antikor penetrasyonuna sahip olma riskini artıracak, bu da objelerin boyanması için yol açacak. Bu nedenle, zaman kazanmak ve prosedürü kısaltmak için tek olası pencere, optimal sonuçlar gerekli olduğunda yaklaşık bir gün sürer doku temizlemek için adanmış zaman, ama bu kalite dramatik bir düşüş olmadan yarım gün azaltılabilir. İkinci sınırlama doku da olası büzülme olduğunu. Gerçekten de, çözücüler kullanarak doku dehydrates herhangi bir protokolde, dokuların su kaldırma nedeniyle küçültmek olasıdır. Bu büzülme tahmin her zaman zordur, ve doku kenarı dehidratasyon işlemi sırasında ayıklanmaya başladığında doku kenarı şeffaf hale geldiğinden, burada neredeyse imkansızdır. Bu nedenle, temizlenmiş dokuların boyut tahminleri dikkatle yorumlanmalıdır. Ancak, fareden farklı genotiplerden elde edilen ve/veya farklı çevre koşullarına gönderilen dokular arasındaki adiposit boyutlarındaki veya damar uzunluğundaki değişikliklerin karşılaştırılması bilgilendirici dir11. Son sınırlama tüm fare yağ dokusu veya büyük bir insan yağ dokusu cerrahi örnek büyük hacimli bağlantılıdır. Gerçekten de, protokol bu büyük örnekleri temizlemek için mükemmel bir şekilde uyarlanmış olsa da, bütün bir organın görüntülenmesi konfokal mikroskopla zordur. Bu sorunu aşmak ve tüm organ temizleme prosedürünün tüm potansiyelini kullanmak için strateji, 4x hedefi kullanarak tüm organın 3D düşük büyütme haritası elde etmek ve 20x uzun mesafe hedefi kullanarak daha yüksek büyütme 3D görüntülerin elde edilebildiği doku içinde rastgele dağılmış belirli alanları seçmektir. "Yüksek büyütme" kurulumu, doku hacminin yaklaşık 45 mm3 (4,7 x 4,7 x 2 mm) görüntülenmesine olanak sağlar. Bu hacim tüm organın hacmiile karşılaştırıldığında sınırlı olmasına rağmen (0.5 ila 4 cm3),doku içinde çeşitli pozisyonlarda kazanımları tekrarlayarak bize hücre altı hücresel çözünürlükte doku iyi bir örnekleme elde etmek için izin verir. Büyük dokuların görüntülenmesinin, depolanmış olması gereken önemli miktarda görüntüleme verisi oluşturacağını unutmayın.
Daha önce yağ dokusu14,30temizlemek için tarif edilmiş yöntemlere göre prosedür önemli farklılıklar vardır. Her şeyden önce, AdipoClear aksine, bu metanol kullanır, diklorotan, ve dibenzylether14, Burada sunulan yöntem dehidratasyon ve temizlenmesi için metil salisilat için etanol kullanır. Bu nedenle, genellikle diklorotan, metanol ve dibenzylether yüksek toksisitesi ile karşılaştırıldığında, genellikle gıda / içecek işleme sanayi (etanol ve metilsalisilat) tarafından kullanılan daha az toksik temizleme çözücüler yararlanır, çünkü prosedür daha güvenlidir. Ayrıca, protokole göre doku hazırlanması AdipoClear protokolü14iki gün daha hızlıdır. Daha yakın zamanda, başka bir yöntem Li ve meslektaşları tarafından gliserol içine daldırarak yağ dokusu parçaları temizlemek için önerilmiştir30. Bu protokol bile bu yordamı ile karşılaştırıldığında çok basittir ve görüntülerin kalitesi yüksek büyütme bile iyidir. Ancak, bu temizleme protokolü sadece 2 mm3 yağ dokusu parçaları kullanırken verimli bir şekilde çalışır. Temizleme işleminden önce dokunun bu küçük numunelere kesilmesi, düşük büyütmede bile 2 mm3'ten büyük doku hacimlerinin görüntülenmesine engel ol. Burada sunulan prosedür, tüm temizlenmiş yağ dokusunun tamamı nda bilinen birkaç pozisyonda 45 mm3 civarında ki 3D görüntü yığınlarının düşük büyütme ve edinimi sırasında 3Boyutlu olarak tüm dokunun haritalanmasına olanak sağlar.
Bu yordamın gelecekteki birkaç uygulaması olabilir. Herhangi bir yöntemde olduğu gibi, burada açıklanan yordam basitleştirilmiş ve/veya daha da optimize edilebilir. Prosedür için ilginç bir ilerleme temizleme sürecinin kombinasyonu gelebilir, biz, ek görüntüleme yaklaşımları ile nitelendirdi. Örneğin, Optik Projeksiyon Tomografisi (OPT), Total Internal Reflection Floresan mikroskobu (TIRF), Seçici Plan Aydınlatma Mikroskobu (SPIM) veya Uyarlanmış Emisyon Tükenme mikroskobu (STED) gibi özel görüntüleme kurulumları prensipte prosedürle uyumludur, ancak bu durum bu sistemlerle donatılmış laboratuvarlarla uygulanabilirliğini sınırlandıracaktır. Alternatif olarak, yüksek sayısal diyafram indeksi ve birçok laboratuvarda bulunan saniyede yüzlerce görüntü elde edebiliyoruz bir satın alma sistemi ile bir hedef kullanarak, bir Süper Çözünürlük Radyal Dalgalanmalar (SRRF) post-processing görüntü analizi freeware31kullanarak süper çözünürlüklü analizler gerçekleştirebilirsiniz. İlginçtir, klasik florokromlar SRRF analizi için uyarlanmıştır, hangi tüm insan ve fare beyaz yağ dokularının 3D süper çözünürlüklü analizsağlayacak.
Protokoldeki birçok kritik adım, takastan önceki doku işlemesiyle ilgilidir. Her şeyden önce, ve klasik histolojik analizler gelince, fiksasyon adım esastır. Zayıf fiksasyon durumunda yapısal özellikler korunmazken, uzatılmış fiksasyon belirli antijen bölgelerinin çapraz bağlanmasına ve engellenmesine ve homojen olmayan immün omünojen boyamaya yol açar. Bir diğer hassas adım da, aşağıda açıkladığımız birkaç kritik noktayı sunan doku ların boyandığıdır. İlk olarak, antikorların işlevsel olduklarını doğrulamak ve optimal konsantrasyonlarını belirlemek için kriyostat kesitleri üzerinde test edilerek doğrulanması gerekir. Temizleme işlemi için kullanılan son konsantrasyon kriyostat bölümler için en uygun konsantrasyonun on katıdır. İkinci olarak, kuluçka süresi de doku büyüklüğü nedeniyle önemlidir. Çok kısa bir kuluçka süresi zayıf veya homojen olmayan immünboyama (örneğin, doku çevresinde doğru boyama ama hiçbir iç boyama) üretecektir. Benzer şekilde, çok kısa olan yıkama adımları, spesifik olmayan boyamalara yol açan dokudan özel olarak bağlı olmayan antikorların çıkarılmasını önleyecektir. Bilgimiz için, antikorlar ile doku genişletilmiş kuluçka boyama zarar vermez. Bu nedenle uzun kuluçka ve yıkama sürelerini şiddetle tavsiye ediyoruz. Üçüncü olarak, florokrom seçimi ilgi sinyaline uyarlanmalıdır. Genel olarak doku örneklerinde ve özellikle beyaz yağ dokusunda ihmal edilemeyen oto floresan 488 nm ve 555 nm'de saptanabilir. Yüksek ifade proteinler için bu bir sorun değildir ve boyama bu kanallarda iyi çalışacaktır. Ancak, düşük ekspresyonlu proteinler için uzak kırmızı florokrom kullanımını şiddetle tavsiye ediyoruz. Açıklık için, metodoloji çok basit olduğundan hiçbir kritik adım vardır. Metil salisilat plastik malzemeler ile uyumlu olmadığını unutmayın, bu nedenle temizleme adımları için cam şişe ve görüntüleme gerçekleştirmek için bir cam alt ile donatılmış metalik bir oda öneririz. Bu montaj prosedürü için alternatifler i) normal bir cam slayt, diş reçine ve cam coverslip (küçük bir cam oda oluşturmak için) veya ii) bir cam petri-çanak (dik mikroskop kurulumları için) kullanarak var.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir çakışmaları yok.
Acknowledgments
Bu çalışma INSERM tarafından desteklenmiştir, Université Côte d'Azur ve Gelecek Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), program UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) Akademi 2 "Systèmes Complexes" ve Akademi 4 "Complexité dalgıç etsité ant revivant du", için Yatırımlar aracılığıyla Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR) hibeleri ile, Fondation pour la Recherche Médical (Équipe FRM DEQ20180839587) ve J.G.'ye Genç Araştırmacı Programı (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). Ayrıca Conseil Départemental des Alpes-Maritimes ve Région PACA tarafından finanse edilen ve IBISA Mikroskobu ve Görüntüleme Platformu Côte d'Azur (MICA) tarafından desteklenen C3M'nin Görüntüleme Çekirdek Tesisine de teşekkür ederiz. Marion Dussot'a doku hazırlığında teknik yardım için teşekkür ederiz. Biz Abby Cuttriss, UCA Uluslararası Bilimsel Görünürlük, makalenin kanıt okuma için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Eppendorff tubes - Dutscher | 33528 | |
| 15 mL plastic tubes | Falcon tubes - Dutscher | 352096 | |
| 18 mm round glass coverslip | Mariendfeld | 0117580 | |
| 20 mL glass bottle | Wheaton | 986546 | |
| anti-mouse-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Dilution: 1/100 |
| anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Dilution: 1/100 |
| BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
| CD301-PE antibody | Biolegend | BLE145703 | Dilution: 1/100 |
| CD31 antibody | AbCam | ab215912 | Dilution: 1/50 |
| Commercial 3D analysis software - IMARIS | Oxford instrument | with Cell module | |
| Confocal microscope - Nikon A1R | Nikon | ||
| Dapi | ThermoFisher | D1306 | Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000 |
| Deoxycholate | Sigma-aldrich | D6750 | |
| DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
| Glut4 antibody | Santa Cruz | sc-53566 | Dilution: 1/50 |
| Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
| Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice |
| Metallic imaging chamber equipped with glass bottom - AttoFluor Chamber | Thermofisher | A7816 | |
| Methyl salicylate | Sigma-aldrich | M6752 | |
| Perilipin antibody | Progen | 651156 | Dilution: 1/50 |
| Phalloidin-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Dilution: 1/100 |
| TCR-β-PB antibody | Biolegend | BLE109225 | Dilution: 1/100 |
| TH antibody | AbCam | ab112 | Dilution: 1/50 |
| Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |
References
- Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues. Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).
- Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk. Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).
- Mittendorfer, B. Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).
- Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity. Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).
- Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. Journal of Diabetes Research. 2015, 970375 (2015).
- Vergoni, B., et al. DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).
- Zwick, R. K., et al. Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation. Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).
- Zhang, L., et al. The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice. Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).
- Yang, H., et al. Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance. Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).
- Laforest, S., et al. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity. 25 (1), Silver Spring. 122-131 (2017).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY. Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Experimental & Molecular Medicine. 48 (12), 274 (2016).
- Zhang, Y., et al. 3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy. Science Advances. 3 (8), 1700553 (2017).
- Ke, M. T., Imai, T. Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB. Current Protocols in Neuroscience. 66, Unit 2 22 (2014).
- Hahn, C., et al. High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO). Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).
- Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Präparaten und Seine Theoretischen. Hierzel, S. , Leipzig. (1911).
- Shields, K. J., Wu, C.
- Bourlier, V., et al. Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages. Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).
- Hill, D. A., et al. Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).
- Acosta, J. R., et al. Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 250 (2017).
- Coppack, S. W.
- Cancello, R., et al. Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss. Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).
- Cinti, S. Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ. Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).
- Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue. Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).
- Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).
- Gustafsson, N., et al. Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations. Nature Communication. 7, 12471 (2016).
